高分辨GC-QTOF MS 法分析煙草中的醛酮類香味成分

閆甜甜，王曉瑜，彭桂新，張峻嶺，王寶林，陳 黎，潘立寧，賈國濤，姚 倩，謝復煒*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001 2. 河南中煙工業有限責任公司技術中心，鄭州經開區第三大街8 號 450000

煙草中的醛酮類化合物是一類重要香味成分，與煙草感官品質和風味緊密相關［1］。如，5-甲基糠醛具有甜香，可增加煙氣豐滿度；β-大馬酮具有強烈的玫瑰清甜香氣，可賦予煙草特征香氣［2］。對國內外煙用添加劑清單、煙用天然香原料的剖析類文獻和煙草煙氣香味成分定性分析文獻［2-5］進行系統調研，發現煙草及煙用添加劑中醛酮類香味成分已超過150 種。因此，建立準確、高通量、快速的煙草醛酮類香味成分檢測方法對卷煙產品的開發與維護具有重要指導意義。

氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）作為分析復雜樣品中揮發性和半揮發性成分的主要工具，目前已廣泛應用于煙草、藥物及食品等領域［6-8］；但在分析復雜樣品時，可能由于特征離子存在干擾或目標物質量分數低，定性及定量上存在假陽性風險［9］。氣相色譜-四極桿飛行時間高分辨質譜（GC-QTOF MS）在對目標化合物進行準確定量、快速篩查及未知化合物結構鑒定等方面具有明顯優勢［10］：一是因TOF 分辨率高、掃描速度快而具有高的質量精確度，通過窄的質量窗口提取，可以排除基質干擾［11］；二是一級全掃描模式數據采集簡單方便，不受掃描時間段和掃描離子個數限制，可采集樣品全部信息，用于數據存檔。在后期數據處理時，可根據不同需要編輯相應的定性定量方法對樣品進行分析［12］。文獻調研結果表明，目前GC-QTOF MS 的相關研究集中在對農藥殘留的篩查［13-15］和復雜樣品中揮發性物質的定性和定量分析［16-17］方 面。2017 年Chen 等［17］采 用GC-QTOF MS 法對煙葉中115 種農藥殘留進行了準確定性定量分析。

本研究中通過優化色譜方法、精確質量提取窗口，基于高分辨GC-QTOF MS 構建了煙草及煙草制品中127 種醛酮類香味成分的定量分析方法；并用該方法檢測了15 個品牌卷煙煙絲中的醛酮類香味成分，旨在為煙草醛酮類香味成分分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

云南曲靖2016 年產C3F 等級煙葉；15 個市售國產品牌卷煙樣品。

QuEChERS 萃 取 試 劑 盒（4 g MgSO4+ 1 g NaCl，美國Agilent 公司）；53 種醛類和74 種酮類標準品（＞95%，美國Sigma-Aldrich 公司、日本TRC公司、北京百靈威科技有限公司、東京化成工業株式會社）；正構烷烴標準品C7～C40（溶劑為正己烷，美國Sigma 公司）；苯乙酮-d8（98 atom% D，美國Sigma-Aldrich 公司）；乙腈（色譜純，美國J T Baker公司）。

7890A-7200 GC-QTOF MS 氣相色譜-質譜聯用儀、7890A-5975C 氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；3-30KS 高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）；EOFO-945066 多管式旋渦混合器（美國Talboys 公司）；Quintix 224-1CN 電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

稱取2.00 g 煙末樣品，加入10 mL 磷酸鹽緩沖液調節pH 為3，泡發5 min，加入10 mL 乙腈以及80 μL 30.0 mg/L 苯乙酮-d8內標工作液，以2 500 r/min的轉速渦旋10 min，放入-18 ℃的冰箱中冷凍10 min；取出后加入QuEChERS 萃取試劑盒（4 g MgSO4+ 1 g NaCl），再以2 500 r/min 的轉速渦旋2 min，7 000 r/min的轉速離心3 min；取1.5 mL 上清液，加入0.2 g 無水硫酸鎂，立即以2 500 r/min 的轉速渦旋2 min，7 000 r/min 的轉速離心3 min；將上清液過0.22 μ m 有機相濾膜，然后分別進行GC-QTOF MS 和GC-MS 分析。

1.2.2 GC-QTOF MS 和GC-MS 分析條件

GC-QTOF MS 分析條件：

色譜柱：DB-5MS UI 彈性石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口端串聯預柱（5 m ×0.25 mm）；載氣：高純He，純度99.999%；恒流模式流速：1.5 mL/min；進樣口溫度：290 ℃；進樣模式：不分流進樣；進樣量：0.8 μL；升溫程序：50 ℃（3 min）5℃/min75 ℃（1 min）1℃/min150 ℃（1 min）2℃/min260℃（1 min）10℃/min290 ℃（10min）。離子源：電子轟擊（EI）；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；掃描模式：一級全掃描；質量掃描范圍：50～300 amu；采集速率：5 spectra/s。

GC-MS分析條件：

色譜條件同GC-QTOF MS；離子源：電子轟擊（EI）；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；掃描模式：全掃描；質量掃描范圍：33～300 amu；掃描速率：Normal。

2 結果與討論

2.1 GC-QTOF MS 條件優化

通過對國內外煙用添加劑清單、煙用天然香原料的剖析文獻以及煙草和煙氣香味成分定性分析文獻進行系統調研，購買了139 種醛酮類香味成分標準品。其中甲乙酮、異丁醛等12 種小分子醛酮類香味成分由于穩定性差、靈敏度低等原因需要通過衍生化分析，因此本研究中共對127 種可直接提取分析的醛酮類香味成分進行分析。

采用本實驗室已建立的方法對煙草樣品進行前處理［18］，對比二氯甲烷和乙腈的提取效果。結果表明采用乙腈的提取效率高于二氯甲烷，如，茄酮、β-紫羅蘭酮、樟腦和苯甲醛采用乙腈的提取效率分別為二氯甲烷的4、2、1.5 和4.5 倍。在已建立方法的基礎上優化了色譜條件，實現了一次進樣對所有目標物的分析。

GC-QTOF MS 能夠以精確質量進行數據采集。在進行數據分析時，合適的質量提取窗口可去除干擾離子、提高靈敏度，使定性、定量更加準確，因此，優化了質量提取窗口。在加標1 000 ng/mL的煙草樣品基質中，考察了順-4-庚烯醛、5-甲基糠醛、苯乙醛、反-2-己烯醛、2-萘乙酮和對甲基苯乙酮在不同質量提取窗口下，各化合物的響應面積和信噪比。結果表明，隨質量窗口變窄，各化合物響應面積減小，信噪比提高。在質量提取窗口為3 至10 mDa 時，化合物響應及信噪比穩定，且信噪比相對較大。圖1a 和圖1b 分別為反-2-己烯醛在不同質量提取窗口下提取特征離子精確質量83.049 1 Da 所得峰面積和信噪比值。對于化合物響應較低的情況，以煙草樣品中的對甲基苯甲醛（特征離子m/z 120.057 0）為例，比較了質量提取窗口為3 至10 mDa 的色譜圖（圖2）。質量窗口為5 mDa（圖2c）和10 mDa（圖2d）時色譜峰峰形較好。綜合考慮不同豐度化合物的響應面積和信噪比等因素，質量提取窗口設定為5 mDa。

圖1 反-2-己烯醛在不同質量提取窗口下化合物豐度及信噪比Fig.1 Compound abundances and signal-to-noise ratios at different mass extraction windows of (E)-2-hexenal

圖2 對甲基苯甲醛在不同質量提取窗口的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 4-methylbenzaldehyde at different mass extraction windows

2.2 醛酮類香味成分數據庫的創建及應用

采用高分辨GC-QTOF MS 對糠醛、β-大馬酮等127 種醛酮類香味成分進行分析，創建了煙草中醛酮類香味成分的數據庫。該數據庫包含每種醛酮類香味成分的高分辨質譜圖、保留指數和精確相對分子質量等信息。首先采用高分辨GC-QTOF MS 分析目標醛酮化合物標準品得到其一級全掃質譜圖和保留時間，根據保留時間，以正構烷烴系列為參考，計算目標化合物的保留指數，采用Agilent MassHunter PCDL Manager 軟件建立醛酮類香味成分數據庫。圖3a 和圖3b 分別為數據庫中苯乙醛和水楊醛的質譜圖，質譜圖中包含各碎片離子的精確離子質量和相對豐度。數據庫中其他化合物信息見表1，經驗證，各化合物精確質量誤差均小于2 mDa。由于該數據庫包含每種醛酮香味成分的保留指數和精確特征離子質量，在沒有標準品的情況下也可以對醛酮類香味成分進行準確定性，因此該數據庫具有廣泛的實際應用價值。

圖3 數據庫中苯乙醛和水楊醛的質譜圖Fig.3 Mass spectra of benzeneacetaldehyde and 2-hydroxybenzaldehyde in the database

表1 127 種醛酮類香味成分理論質量、數據庫中質量、質量誤差和保留指數Tab.1 Theoretical masses, measured masses in the database, mass errors and retention indexes of 127 aldehyde and ketone aroma components

表1（續1）

表1（續2）

表1（續3）

在對實際樣品進行定性分析時，可通過實際質譜圖與高分辨質譜圖匹配鑒定醛酮類香味成分。也可使用Agilent MassHunter 定性分析軟件中“按分子式查找”對化合物進行定性，設定目標源為建立的醛酮類香味成分數據庫，質量提取窗口為5 mDa，進行精確質量提取，以兩個以上特征離子準確檢出，特征離子豐度比和保留時間/指數與數據庫中一致作為定性依據，該定性依據符合歐盟質譜方法定性確證標準［20］。如苯乙醛與水楊醛的保留時間分別為20.55 和20.59 min，其特征離子見表2。在煙絲樣品中，保留時間20.59 min 對應的質譜圖如圖4a 所示，由于水楊醛質量分數低，特征離子質譜豐度低于500（圖4b），采用NIST 質譜庫匹配時，僅可匹配到苯乙醛。采用定性軟件進行查找時，苯乙醛和水楊醛均可準確定性。圖5為水楊醛的特征離子提取離子流圖，特征離子豐度比與數據庫中一致（圖3b）。由表2 可知，煙絲樣品中干擾離子質量誤差小于500 mDa，采用傳統GC-MS 提取時無法去除干擾離子，高分辨GC-QTOF MS 法定性更加準確。

表2 苯乙醛和水楊醛的特征離子信息Tab.2 Information of characteristic ions of benzeneacetaldehyde and 2-hydroxybenzaldehyde

圖4 在煙絲樣品中保留時間20.59 min 處峰的質譜圖和水楊醛的特征離子質譜圖Fig.4 Mass spectra of peak and characteristic ions of 2-hydroxybenzaldehyde at retention time 20.59 min in cut tobacco sample

圖5 在煙絲樣品中水楊醛的特征離子提取離子流圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of characteristic ions of 2-hydroxybenzaldehyde in cut tobacco sample

2.3 GC-QTOF MS 定量分析

GC-QTOF MS 能夠以精確質量進行全掃描并通過窄的質量窗口提取去除干擾離子峰、提高信噪比，使定量結果更加準確。通過對比樟腦和2-乙酰基-5-甲基呋喃在傳統GC-MS 與高分辨GC-QTOF MS 條件下的提取離子流圖，證明采用GC-QTOF MS 法通過窄的質量窗口提取可提高靈敏度，去除干擾離子。煙草樣品中樟腦（特征離子m/z 98.085 5）的保留時間為31.03 min，圖6a 是傳統GC-MS 提取質量數95 Da 的離子流圖，由于背景噪音過大，無法識別化合物信號。在GC-QTOF MS 全掃描條件下，設定質量提取窗口為±500 mDa時，化合物信噪比小于3（圖6b）。當質量提取窗口縮小到±5 mDa 時，信噪比明顯提高（圖6c）。煙草樣品基質中2-乙酰基-5-甲基呋喃（特征離子m/z 109.028 4）的保留時間為20.60 min，圖7a 為傳統GC-MS 提取質量數109 Da 的色譜圖，在其右側出現較大干擾峰。以±500 mDa 質量窗口提取的色譜圖（圖7b）與傳統GC-MS 色譜圖一樣有較大干擾。圖7b 中1#色譜峰的質譜圖如圖8a 所示，基質中2-乙酰基-5-甲基呋喃的特征離子精確質量為109.027 3 Da。2#干擾峰中干擾離子的精確質量為109.059 3 Da（圖8b），與目標離子精確質量109.028 4 Da 相差30.9 mDa，當質量提取窗口為±5 mDa 時，可去除干擾離子109.059 3 Da（圖7c），使定量更加準確。

在對目標醛酮類化合物進行定量分析中，質量提取窗口為±500 mDa 時，2,2,6-三甲基環己酮、2,3-二甲基-2-環戊烯-1-酮等12 種目標醛酮化合物存在干擾。當質量提取窗口為±5 mDa 時，可以去除干擾，實現對目標醛酮準確定量分析。

圖6 樟腦在GC-MS 和GC-QTOF MS 全掃描模式下提取的離子流圖Fig.6 Extracted ion chromatograms of camphor by GC-MS and GC-QTOF MS under full scan mode

圖7 2-乙酰基-5-甲基呋喃在GC-MS 和GC-QTOF MS 全掃描模式下提取的離子流圖Fig.7 Extracted ion chromatograms of 2-acetyl-5-methylfuran by GC-MS and GC-QTOF MS under full scan mode

圖8 圖7b 中1#和2#號色譜峰的質譜圖Fig.8 Mass spectra of 1# and 2# chromatogram peaks in Fig.7b

2.4 GC-QTOF MS 定量分析方法的建立與表征

為了減少基質效應［18］對醛酮類香味成分定量的影響，采用基質匹配標準溶液進行標準曲線的繪制，實驗過程中均以5～7 個標準濃度點繪制標準曲線，基質添加標準溶液濃度范圍見表3。由于巨豆三烯酮、金合歡基丙酮等標準品為同分異構體混合物，在定量分析中將同分異構體合并計算。以苯乙酮-d8為內標校正儀器響應，考察低、中、高3 個水平的加標回收率和日內精密度，并在中添加水平下進行日間精密度（n=6）考察，以10倍信噪比作為方法定量限。線性范圍、加標回收率、定量限（LOQ）和日間精密度見表3。結果顯示，127 種醛酮類化合物均具有良好的線性關系（r2＞0.99）。3 個添加水平下，平均回收率在61.8%～132.6%間，相對標準偏差（RSDs）（n=5）均小于20%，在低、中添加水平下，辛醛、苯甲醛、對甲基苯甲醛的平均回收率高于120%，十一醛、麝香酮等9 種化合物的平均回收率低于70%。可能由于目標化合物數量較多，實驗中采用單一內標校正，無法保證所有化合物的分析條件均為最佳條件；此外，在濃度較低時，部分化合物存在吸附現象。所有化合物的日間RSD（n=6）均小于20%，其中115 種化合物的日間RSD 小于10%。有95 種醛酮化合物的LOQ 在6～100 μg/kg 之間，21 種化合物的LOQ 在100～500 μg/kg 之間，11 種化合物的LOQ 在500～5 000 μg/kg 之間。該方法線性關系、回收率和精密度均良好，可滿足實際卷煙煙絲樣品中半揮發性醛酮類香味成分的分析。

由于GC-QTOF MS 法需要以精確質量掃描樣品中全部離子，與進行選擇性離子檢測的傳統GC-MS法的SIM模式和GC-MS/MS 法的MRM 掃描模式相比，靈敏度較低［16］。對比63 種醛酮類化合物的定量限（表3），可知GC-MS/MS 的MRM 掃描模式下定量限低于100 μg/kg 的化合物有62 種，而GC-QTOF MS 全掃描模式下定量限低于100 μg/kg 的化合物有49 種。

表3 127 種醛酮類化合物的線性范圍、回收率（n=5）、日間精密度和定量限①Tab.3 Linear ranges, recoveries (n=5), inter-day precision (RSDs) and limits of quantification (LOQs)of 127 aldehyde and ketone compounds

表3（續1）

表3（續2）

2.5 卷煙煙絲樣品分析

采用已建立的方法對國內15 個品牌卷煙煙絲樣品的分析結果見表4。15 個品牌卷煙煙絲共檢測到63 種醛酮類香味成分，包括22 種醛和41 種酮。3-庚烯-2-酮、鄰甲基苯甲醛、對甲氧基苯乙酮等可能由于在煙絲中的質量分數低于本方法定量限而未檢出。定量結果顯示，卷煙煙絲中質量分數最高的是茄酮，其次是巨豆三烯酮、苯乙醛和糠醛。59 種醛酮類化合物在15 個品牌卷煙煙絲中均有檢出，其中不同品牌中煙酮、苯甲醛等14種成分質量分數的最大值為最小值的兩倍以上。乙基香蘭素、乙基麥芽酚、乙基環戊烯醇酮和紫蘇醛4 種化合物可能為添加的香味成分，僅在部分樣品中有檢出，其樣品數分別是7、11、3 和2 個。

乙基香蘭素在1#～4#、10#、12#、13#號樣品中有檢出，質量分數在0.15～0.65 mg/kg 之間。乙基環戊烯醇酮僅在1#、2#和11#號樣品中有檢出，質量分數分別為1.84、2.75 和0.63 mg/kg。紫蘇醛僅在8#和9#號樣品中有檢出，質量分數分別為0.96 和0.80 mg/kg。乙基麥芽酚在1#～11#號樣品中有檢出，質量分數在0.16～33.8 mg/kg 之間，8#和9#號樣品中質量分數分別為23.2 和33.8 mg/kg，其他樣品中質量分數均低于3.81 mg/kg。從以上結果可知，不同卷煙煙絲樣品在加香加料方面有差異。

表4 15 個不同品牌卷煙煙絲中醛酮類香味成分分析結果①Tab.4 Analysis results of aldehyde and ketone aroma components in cut tobacco samples of 15 cigarette brands

3 結論

①基于高分辨GC-QTOF MS 建立了127 種醛酮類香味成分的數據庫和準確定量分析方法，與傳統GC-MS 全掃描模式相比，GC-QTOF MS 通過精確質量提取可去除干擾離子，提高靈敏度，實現煙絲中醛酮類香味成分的準確分析。②由于GC-QTOF MS 需要以精確質量掃描樣品中全部離子，該方法比GC-MS/MS 的MRM 模式靈敏度低。③該方法具有高通量、定性定量準確等優點，可用于煙草中醛酮類半揮發性香味成分的分析。