不同溶劑同時蒸餾萃取艾葉揮發油的抑菌活性

葛德鵬， 李 森， 黃 凱， 管 驍

（上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海200093）

艾草（Artemisia argyi），別名:香艾、蘄艾、艾蒿。艾草是多年生草本或略成半灌木狀植物，植株有濃烈香氣。 分布廣，除極干旱與高寒地區外，幾乎遍及全國[1]。 《本草綱目》記載“蘄艾”可入藥，其植株高大，香氣濃烈；葉厚紙質，被毛密而厚。 艾葉是傳統的中醫藥原料，不僅可改善哮喘、咳嗽，亦能疏通血液[2]，而實現這些功效的物質主要是艾葉揮發油。 現已有眾多科學研究表明艾葉揮發油能快速緩解哮喘等病狀，并且其對金黃色葡萄球菌、痢疾芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌和假單胞菌等常見的微生物的生長具有顯著的抑制作用[3]。

但艾葉揮發油的化學成分不僅十分復雜而且種類繁多，不同的提取方法會對精油的成分造成很大的差異，因此采取適當的提取條件，最大程度地獲得其中的抑菌成分，是艾葉開發利用的基礎。 目前，對于艾葉揮發性油的化學成分及其生物活性已有一些報道，但對提取工藝優化研究的報道較少并且局限于水蒸氣蒸餾、有機溶劑滲漉法、超臨界CO2等傳統提取法，這些方法在提取艾葉揮發性油的過程中，存在揮發性油有效成分的破壞，有機溶劑難以分離，操作難度大成本高等問題[4-6]。 同時蒸餾萃取（SDE）在揮發油提取上具有明顯的優勢，集合水蒸氣蒸餾及溶劑萃取的優點，提取時間短、溶劑使用少；使得樣品的揮發蒸汽和溶劑反復混合，達到充分提取的效果[7-8]。 同時蒸餾萃取雖然早在1946年就被發明使用，但并沒有廣泛的應用到揮發油的萃取中來。 因此充分的利用這種方法，將其應用到艾葉揮發油的提取上來，必將會促進艾葉的開發應用。

作者采用二氯甲烷和正己烷2 種溶劑，通過同時蒸餾萃取獲得艾葉揮發油，進而研究揮發性油對常見微生物的抑菌活性，并對揮發油采用氣相色譜結合質譜（GC-MS）的方法進行成分分析，以及通過掃描電鏡（SEM）來觀測微生物細胞形態的變化，比較不同工藝的差異。 對比傳統的水蒸氣蒸餾的方法，從而挑選出艾葉揮發油的較優提取工藝，深入研究艾葉揮發油的提取工藝和揮發性油的抗菌活性，為艾葉的綜合開發利用提供了實驗依據。

1材料與方法

1.1 材料與設備

艾葉，購于湖北省蘄春；二氯甲烷和正己烷為分析純，培養基及相應實驗耗材均購于國藥集團化學試劑有限公司。

Agilent 6890N-5973i 氣相色譜—質譜聯用儀（色譜柱：DB - WAX 毛細管柱，30.0 m×250 μm×0.25 μm）、Agilent 7890N - 5875i （色譜柱：HP - 5毛細管柱，30.0 m×250 μm×0.25 μm）， 美國安捷倫科技有限公司產品；同時蒸餾萃取裝置，上海高信化玻儀器有限公司產品。

革蘭氏陽性菌： 金黃色葡萄球菌ATCC 6538、枯草芽孢桿菌CMCC B63501、單增李斯特菌ATCC 19115；革蘭氏陰性菌：大腸桿菌ATCC 12900、變形桿菌CMCC B49027、腸炎沙門氏菌ATCC 13076；真菌：黑曲霉ATCC 6633、釀酒酵母ATCC 9763，以上菌種均由上海理工大學醫療器械與食品學院提供，并于-80 ℃存放。

1.2 艾葉揮發油提取

1.2.1 水蒸氣蒸餾提取 依據權美平的研究[9]，稱取100 g 艾葉原料，放入2000 mL 圓底燒瓶中，加入1500 mL 去離子水，加熱煮沸，3 h 后，收集提取物，計算提取率。 低溫密封保存，留用。

其中m 表示質量。

1.2.2 同時蒸餾萃取 同時蒸餾萃取使用圖1 所示裝置，組裝好同時蒸餾萃取裝置，參照夏雪娟[10]的方法，稱取100 g 艾葉原料，放入2000 mL 圓底燒瓶中，加入1500 mL 的去離子水；量取25 mL 二氯甲烷加入100 mL 圓底燒瓶中；開始加熱。 萃取3 h后，收集提取物，使用旋轉蒸發儀濃縮后，計算提取率，低溫密封保存，留用。

將二氯甲烷換為正己烷，重復上述操作。 萃取3 h 后，收集提取物，使用旋轉蒸發儀濃縮后，計算提取率，低溫密封保存，留用。

1.3 抑菌活性

揮發油的成分決定其抑菌活性，而不同提取工藝會對揮發油成分產生很大的影響，因此對以上獲得的3 種揮發油進行目標菌種的抑菌活性研究，分析提取工藝對抑菌活性的影響。

1.3.1 抑菌圈試驗 吸取100 μL 活化后的金黃色葡萄球菌菌液均勻涂布到營養瓊脂固體培養基上，將培養基等分成4 個區域，在各個區域中間放置準備好的直徑6 mm 的濾紙片， 移液槍吸取10 μL 水蒸氣蒸餾提取物滴至濾紙片中間，迅速蓋上培養皿蓋，用密封膜密封，放置培養箱中，37 ℃培養24 h，2種溶劑體系下的同時蒸餾萃取物重復以上步驟，觀察結果。 其它菌種選擇相應的培養基和培養條件，重復以上步驟，獲得抑菌圈實驗結果[11]。

圖1 同時蒸餾萃取裝置Fig. 1 Schematic diagram of the simultaneous distillation and extraction experimental apparatus.

1.3.2 最低抑菌濃度 將3 種揮發油提取物用體積分數50%的乙醇由50 μL/mL 起，二倍稀釋10 個濃度梯度，至0.05 μL/mL；吸取100 μL 活化后金黃色葡萄球菌菌液以及等量的相應梯度濃度的提取物，混合均勻后，均勻涂布到營養瓊脂培養基上，迅速蓋上培養皿蓋，用密封膜密封，放置培養箱中，37 ℃培養24 h，觀察結果。其它菌種選擇相應的培養基和培養條件，重復以上步驟，獲得抑菌圈實驗結果[12]。

1.4 GC-MS 成分分析

色譜柱型號：HP-5 MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm，柱溫程序： 起始溫度50 ℃保持1 min， 以4 ℃/min速度升溫至200 ℃，保持1 min，再以20 ℃/min 的速度升溫至280 ℃保持至完成分析； 進樣口溫度250 ℃；載氣為He，流速為1 mL/min；進樣量1 μL，分流比為40∶1；70 eV 電子轟擊離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，溶劑延遲5 min，質量范圍10～550 amu。

1.5 掃描電鏡SEM 微生物形態變化觀察

收集以上最低抑菌濃度測定實驗后的樣品，在3000 r/min 的條件下離心15 min，收集沉淀，加入pH 7.4 的PBS 洗滌2 次后，再次離心，再加入體積分數2.5%的戊二醛（pH7.4 的PBS 稀釋），在4 ℃下固定過夜（16 h），再次使用pH 7.4 的PBS 沖洗，使用乙醇梯度脫水，冷凍干燥，噴重金屬進行SEM 觀察并拍攝細胞形態[13-14]。

2結果與討論

2.13 種工藝提取艾葉揮發油結果分析

按照選擇的提取方法以及設置的提取條件，獲得的提取物通過脫水后測定得率。 結果如表1 顯示，3 種提取工藝均可獲得艾葉揮發油，但傳統的水蒸氣蒸餾工藝需要提取4 h 才能最大限度的將揮發油提取完全，相較于同時蒸餾萃取工藝來說，多用了1 h；而在得率上，同時蒸餾萃?。ǘ燃淄椋┑寐蕿?.5%，同時蒸餾萃?。ㄕ和椋┑寐蕿?.2%，2 種工藝的提取率相似， 且均高于水蒸氣蒸餾的0.5%；在顏色上，水蒸氣蒸餾萃取得物顏色更深，這可能因為長時間的高溫提取，使得揮發油得物的成分發生改變，分解或合成一些深色的成分；而同時蒸餾萃取工藝的提取時間較短，因而這種化學成分的變化幾率較低，比水蒸氣蒸餾萃取得物的顏色淺[15]。由以上結果，同時蒸餾萃取工藝相對于傳統的艾葉揮發油提取方法水蒸氣蒸餾萃取在提取時間和提取率上更具有優勢。

表13 種工藝提取艾葉揮發油的提取結果Table 1 Yield of Artemisia argyi essential oils obtained by three different extraction methods

2.2 艾葉揮發油的抑菌活性結果分析

不同的提取工藝不僅對艾葉揮發油的提取率以及顏色和氣味等產生影響，對其生物活性有很大的影響。 抑菌活性是艾葉揮發油的一種重要的生物活性，因此這里對3 種工藝提取的艾葉揮發油的抑菌活性進行了研究。 包括抑菌圈和最低抑菌濃度試驗，結果分別如圖2 和圖3 所示。

由圖2 可知，3 種工藝提取的艾葉揮發油都具有廣譜的抑菌活性，水蒸氣蒸餾萃取得物的抑菌圈結果是0.935～1.823 cm，但對革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、變形桿菌、沙門氏菌）以及單增李斯特菌和真菌的結果主要集中在1 cm；SDE（正己烷）得物的范圍在1.123～1.580 cm， 且對革蘭氏陽性菌和陰性菌的結果主要集中在1.5 cm；SDE（二氯甲烷）得物的范圍在0.728～1.528 cm， 但對多數受試菌的抑菌圈結果均在1 cm 以下。最低抑菌濃度（MIC）的結果又印證了抑菌圈結果，水蒸氣蒸餾萃取得物對革蘭氏陽性菌以及真菌的MIC 結果均為6.25 μL/mL，但對變形桿菌的MIC 達到25 μL/mL；SDE（正己烷）對革蘭氏陰性菌及真菌的MIC 結果均為6.25 μL/mL，對其它菌種的MIC 結果最高為12.5 μL/mL；SDE （二氯甲烷）對所有受試菌種的MIC 結果均大于12.5 μL/mL，甚至對沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、黑曲霉的MIC 結果達到了25 μL/mL。

圖23 種工藝提取艾葉揮發油的抑菌圈試驗結果 （抑菌圈直徑）Fig. 2 Inhibition zone of Artemisia argyi essential oils against various microorganisms

圖33 種工藝提取艾葉揮發油的最低抑菌濃度（MIC）Fig. 3 Minimum inhibitory concentration （MIC） of Artemisia argyi essential oils against various microorganisms

綜合以上抑菌圈和最低抑菌濃度的結果，從受試菌來說，實驗中的革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌）相對于革蘭氏陰性菌和真菌對艾葉揮發油更敏感， 其抑菌圈更大，最低抑菌濃度更小；從提取工藝來說，SDE（正己烷）得到的揮發油的抑菌活性比其余2 種工藝更具有廣譜抑菌性，且抑菌圈更大，最低抑菌濃度更低，更具有優勢。 而SDE（二氯甲烷）的揮發油得物的抑菌活性低于另外2 種工藝的揮發油得物。

由此可見，不同提取方法獲得的艾葉揮發油的抑菌活性存在很大的差異，甚至同一種方法，不同溶劑下，其抑菌活性的差異也很大。 但得到這樣的結果，可能是因為由于萃取時間長，水蒸氣蒸餾萃取獲得的揮發油的成分比SDE 的種類多，抑菌活性受多種成分協同的作用可能性大，因此水蒸氣蒸餾萃取得物對受試菌也有一定的抑制活性。 SDE 使用了有機溶劑，可能將揮發油中有抑菌活性的主要成分聚集，因此SDE（正己烷）的抑菌活性超過了水蒸氣蒸餾萃取的得物；但不同溶劑存在極性等性質的差異，造成得到的艾葉揮發油的成分種類，或者含量不同[16]，因此SDE（二氯甲烷）得物的抑菌活性比其余兩者較弱。

2.3 GC-MS 成分分析結果

不同的提取工藝會對揮發油的成分產生影響，因此本研究進一步對3 種工藝提取獲得的艾葉揮發油進行GC-MS 成分分析，結果如表2 所示。 水蒸氣蒸餾萃取得物有66 種成分，SDE（二氯甲烷）得物有37 種成分，SDE（正己烷）得物有10 種成分；其中α-側柏酮、右旋樟腦、β-石竹烯、龍腦、氧化石竹烯、甲乙烯基萘酚等是3 種工藝得物的公共主要成分，這6 種成分分別占水蒸氣蒸餾得物、SDE （二氯甲烷）、SDE （正己烷） 總成分的44.23%、52.42%、92.95%。 由此可見，不同提取方法之間在得物的成分種類數量上存在很大差異，不同溶劑下同時蒸餾萃取得物的成分種類也有很大差異。 造成這種結果的原因可能是因為提取時間的長短造成得物成分的差異，而溶劑的極性等性質的差異也是得物成分差異的主要原因[17-18]。

綜合以上結果，不同工藝的艾葉揮發油得物在成分的種類和含量上確實有很大差異，因此這種結果亦能解釋抑菌活性的差異。 SDE（正己烷）的得物成分種類數量遠遠不如其余2 種工藝的得物，但其3 種工藝的得物的公共成分含量最高， 這些成分可能是艾葉揮發油抑菌活性的有效成分， 因此SDE（正己烷）的抑菌效果優于其余2 種工藝的得物。

表23 種工藝提取艾葉揮發油的GC-MS 分析結果Table 2 Chemical composition (in percent) of Artemisia argyi essential oils obtained by three different methods

續表2

2.4 掃描電鏡結果分析

通過抑菌活性的結果可知革蘭氏陽性菌對艾葉揮發油更具有敏感性，而金黃色葡萄球菌的敏感程度尤為突出，為進一步驗證3 種工藝得物的抑菌活性的差異， 以及深入探索艾葉揮發油的抑菌機制，本研究進而以處理后的金黃色葡萄球菌為目標菌種， 采用掃描電鏡的方法觀察細胞的形態變化，其結果如圖4 所示。

圖43 種工藝提取艾葉揮發油的SEM 分析結果Fig. 4 SEM results of Artemisia argyi essential oils obtained by three different methods

從圖中可以看出細胞排列緊密，呈現出典型的葡萄球狀，而經過3 種工藝提取得到的艾葉揮發油處理金黃色葡萄球菌后的細胞形態 （圖4 中（a）、（b）、（c））與未使用艾葉揮發油處理的金黃色葡萄球菌的細胞形態（圖4 中（d））存在明顯差異。 （d）中因為培養時間的延長和后期的處理，出現了微弱的細胞破碎[19-20]，如（d）中圓圈所示；（a）、（b）、（c）中均出現了明顯的細胞形態變化及細胞破碎，且程度都強于未由艾葉揮發油處理的（d）；（a）、（b）、（c）中的細胞形態變化進一步證明艾葉揮發油具有明顯的抑菌活性，而細胞的破碎和變形，說明艾葉揮發油的抑菌活性可能是因為對微生物的細胞壁結構的破壞完成的。

3結 語

作者將同時蒸餾萃取作為艾葉揮發油的提取方法，使用同時蒸餾萃取常用的二氯甲烷作為提取溶劑， 引用未曾廣泛使用的正己烷作為第2 種溶劑， 對比傳統的艾葉揮發油的水蒸氣蒸餾萃取法，系統的分析了提取率和工藝用時， 得知SDE 用時少，提取率高；通過抑菌活性的研究，得知SDE（正己烷）的抑菌活性強于其它2 種工藝；而對得物成分的GC-MS 分析結果可知SDE（正己烷）雖然成分種類最少，但主要的成分含量很多，因此正己烷有望成為同時蒸餾萃取方法的重要溶劑；掃描電鏡的分析結果進一步揭示艾葉揮發油的顯著抑菌效果，并表明艾葉揮發油會作用于微生物細胞壁結構，從而達到抑菌效果。 但深入的抑菌機理，主要的抑菌活性成分還尚待在以后的研究中繼續探索。