L-天冬酰胺酶的補料分批發酵

王云龍， 劉 松， 馮 岳， 堵國成， 陳 堅*

（1. 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

L-天冬酰胺酶(L-Asparaginase，EC 3.5.1.1，LASNase)是一種酰胺基水解酶，可以將天冬酰胺脫氨基生成天冬氨酸和氨[1]。 該酶具有抗腫瘤活性，已被用于治療淋巴系統惡性腫瘤、兒童急性淋巴細胞白血病、網狀細胞肉瘤及霍金森病等疾病[2]。 最新報道中顯示該酶也可用于油炸食品中以減少丙烯酰胺的生成[3-4]。 由于L-ASNase 在食品與醫藥領域中的重要應用，已引起國內外廣大學者的極大興趣。

L-ASNase 廣泛存在于動植物及微生物中[5]。 但是由于動植物中L-ASNase 含量少， 分離提取操作困難，而微生物發酵法具有培養簡單、提取純化簡便以及易于大規模生產等優點， 已成為商品化LASNase 的主要來源[6]。 由于野生菌發酵L-ASNase產量往往較低[7-8]，國內外學者開始構建L-ASNase酶重組菌并對其發酵條件進行優化。 Khushoo 等人通過指數流加策略控制重組菌E.coliBLR（DE3）比生長速率并優化誘導劑添加時間， 使L-ASNase 酶活達到870 U/mL[9]。 龍水清通過雙階段控制溶氧策略促進B. subtilis168/pMA5-ansz產酶，總酶活達到112.61 U/mL[10]。 Chityala 等人 在B.subtilisWB800N中表達P.carotovorumMTCC 1428 來源的L-ASNase基因， 通過統計學方法及持續誘導策略使LASNase 的產量達到525.98 U/mL[11]。

本研究以研究室前期構建的菌株Bacillus subtilis/ASNΔ25/B2 為生產菌株[12]，擬在優化攪拌轉速的基礎上對其補料分批發酵條件進行研究，考察了補料時間、補料培養基組成、補料量以及流加方式對菌體生長和產酶的影響， 建立了3 L 發酵罐發酵工藝，為L-ASNase 工業化生產提供重要參考。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株：Bacillus subtilis/ASNΔ25/B2[12]，由江南大學生物系統與生物加工工程研究室構建并保藏。

XWY-240 恒溫搖床： 上海智誠儀器有限公司產品；3 L 發酵罐：迪必爾生物工程（上海）有限公司產品；Agilent 1260 System 高效液相色譜儀： 美國Agilent 公司產品；臺式高速離心機：德國eppendorf公司產品；UV-2450 型紫外-可見分光光度計：日本Shimadzu 公司產品；pH 計：瑞士Mettler 公司產品。

1.2 培養基

1.2.1 卡那平板培養基（g/L） 胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，瓊脂20，硫酸卡那霉素0.05。

1.2.2 種子培養基（g/L） 胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，硫酸卡那霉素0.05。

1.2.3 發酵培養基（g/L） 酵母蛋白胨28.0，硫酸銨4.0， 玉 米 漿11.0，K2HPO4·3H2O 22.5，KH2PO411.5，MgSO4·7H2O 1.0，NaCl 3.3，L-天冬酰胺2，蔗糖65.0，硫酸卡那霉素0.05；初始pH 7.5。

1.2.4 補料培養基（g/L） 碳源：蔗糖800；混合氮源：酵母蛋白胨200，玉米漿80。

1.3 培養方法

1.3.1 種子活化 取適量保存在冷凍甘油管中的菌液涂布至卡那平板上，37 ℃培養過夜。

1.3.2 種子培養 將活化好的種子接種至裝有60 mL種子培養基的500 mL 三角瓶中，添加60 μL的50 mg/mL 硫酸卡那霉素，搖床溫度37 ℃，轉速220 r/min，培養8～10 h。

1.3.3 搖瓶發酵培養 按體積分數4%的接種量將種子培養基接入裝有25 mL 發酵培養基的250 mL搖瓶中，溫度37 ℃，轉速220 r/min。

1.3.4 發酵罐發酵培養 按體積分數4%的接種量將種子培養基接入裝有1.5 L 發酵培養基的3 L 發酵罐中，通氣量2 vvm，溫度37 ℃，初始pH 7.5。 本研究中所有實驗重復3 次取其平均值。

1.3.5 補料分批發酵 0～8 h 攪拌轉速為700 r/min，8 h 以后攪拌轉速為900 r/min。16 ～28 h 以32 mL/h平均流速進行恒速流加酵母蛋白胨和玉米漿混合氮源。

間歇性流加：16 h 開始每隔2 h 補加37.5 mL 蔗糖。

恒速流加：16～28 h 以平均流速18.75 mL/h 恒速流加蔗糖。

指數流加：蔗糖流加速率按如下公式計算：

式中F（t）為蔗糖流加速率（L/h），μset為設定的比生長速率（0.2 h-1），X0代表初始菌體干質量濃度（g/L），V0為初始發酵液體積（L），t為指數流加的時間（h），Sf為補加的蔗糖質量濃度（800 g/L），S0為指數流加開始時的殘留蔗糖質量濃度（g/L），YX/S為菌體對底物的得率系數（0.29 g/g）。

1.4 分析方法

1.4.1 菌體濃度的測定 采用濁度法測定。 取適量發酵液稀釋到適當倍數后使用紫外分光光度計于波長600 nm 下測定吸光度，即OD600。

1.4.2 L-ASNase 粗酶液制備 取一定量的發酵液12000 r/min 離心10 min，上清液即為L-ASNase 粗酶液。

1.4.3 L-ASNase 酶活測定 采用奈氏試劑法[13]。取900 μL 磷酸鹽緩沖液 （20 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液，pH 7.5）加入200 μL 底物（L-天冬酰胺，0.15 mol/L）于37 ℃保溫10～20 min 后， 加入100 μL 稀釋到適當倍數的L-ASNase 粗酶液，37 ℃反應10 min 后加入100 μL 終止劑（三氯乙酸，1.5 mol/L）終止反應，對照組在保溫前即加入終止劑。 反應結束后12000 r/min 離心2 min，取100 μL 上清液，加入3400 μL 去離子水和500 μL 奈氏試劑， 混勻后在波長436 nm 下測定吸光度。

酶活力單位定義：37 ℃每分鐘水解L-天冬酰胺生成1 μmol 氨所需要的酶量定義為一個LASNase 活力單位。

1.4.4 蔗糖質量濃度測定 采用高效液相色譜法[12]。液相儀：Agilent 1260；檢測器：RID；色譜柱：Aminex HPX-87H，300 mm×7.8 mm 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相：5 mmol/L 硫酸； 流速：0.6 mL/min；柱溫：40 ℃，進樣體積為10 μL。

1.4.5 比速率的計算 使用Origin 軟件處理[14]。

2 結果與討論

2.1 攪拌轉速對L-ASNase 分批發酵過程的影響

在發酵過程中攪拌轉速一方面會影響到環境中溶氧（DO）的變化，另一方面過大的轉速產生剪切力也會影響到細胞的生長[15]，發酵液中的溶氧水平對L-ASNase 的合成影響較大[16-17]。 故在3 L 發酵罐水平進行分批發酵， 考察攪拌轉速對B.subtilis/ASNΔ25/B2 菌體生長和產酶的影響，共選取了600、700、800、900 r/min 4 個轉速進行研究。 不同攪拌轉速發酵過程中溶氧的變化情況如圖1（a）所示，在整個發酵過程中溶氧呈先下降后上升的趨勢。 在0～20 h，由于菌體生長代謝作用需要消耗大量溶解氧，溶氧水平一直呈下降趨勢， 而后期需氧量明顯下降。 不同的攪拌轉速所能提供的溶氧水平差異較大，600 r/min 在8 h 時DO 只有10.9%，8～24 h DO一直處于很低的水平， 接近于0；700 r/min 在12 h之后溶氧迅速下降到0.9%；800 r/min 能維持DO 在20%以上；900 r/min 能維持DO 在30%以上。

不同攪拌轉速下OD600隨時間變化情況如圖1（b）所示。 與攪拌轉速600 r/min 相比，700、800、900 r/min 條件下OD600分別提高了4.9%、14.5%、14.9%。 這是因為枯草芽孢桿菌是好氧微生物[10]，而600 r/min 和700 r/min 溶氧均在16～24 h 處于較低水平，影響了菌體生長。

不同攪拌轉速下菌體比生長速率變化情況如圖1（c）所示，比生長速率均呈現先增大后減小的趨勢，600、700、800、900 r/min 比生長速率分別在6.5、5、5、5.5 h 達到最大。在8 h 前由于溶氧充足，而700 r/min剪切力小，故其比生長速率高于其他轉速。在8 h 以后，菌體已經進入對數生長期，對溶氧要求較高，而高轉速能提供更高的溶解氧， 更適合菌體生長，故900 r/min 比生長速率高于700 r/min。

結合圖1（b）和圖1（d）可知B.subtilis/ASNΔ25/B2 產L-ASNase 屬于延續合成型。在0 ～ 24 h，隨著菌體的生長L-ASNase 酶活也逐漸增加， 當菌體進入穩定期后產酶依然繼續，且酶活和生物量呈正相關。 與攪拌轉速600 r/min 相比，700、800 r/min 和900 r/min 條件下酶活分別提高9.4%、25.4%和25.9%。發酵前期， 不同攪拌轉速下L-ASNase 的比產酶速率接近，8 h 之后900 r/min 的比產酶速率要明顯高于其他轉速。 這說明較高的溶氧不僅對菌體生長有利，也可促進菌體產酶。

根據上述結果， 為了進一步提高L-ASNase 產量， 提出兩階段控制攪拌轉速策略即0～8 h 將攪拌轉速控制在700 r/min，8 h 之后將攪拌轉速控制在900 r/min。 發酵過程曲線如圖1（f）所示，溶氧水平能維持在30%以上， 可以滿足菌體對溶氧的要求，發酵周期由40 h 提前到36 h，最大酶活也進一步提高，達到850.6 U/mL。 不同攪拌轉速下發酵過程參數見表1，與恒定轉速600 r/min 相比，兩階段控制轉速條件下菌體OD600、酶活和生產強度分別提高了18.8%、31.9%、46.6%。

2.2 補料時間對L-ASNase 補料分批發酵過程的影響

兩階段控制攪拌轉速分批發酵過程中蔗糖消耗情況如圖2（a）所示，隨著發酵過程的進行，蔗糖不斷消耗，在20 h 即將耗盡。如果增加蔗糖供應，可能會進一步提高菌體量和酶產量。 在分批發酵過程中，發酵液中殘留蔗糖質量濃度一直在減小，菌體對蔗糖的消耗速度也在不斷發生變化，在不同時間開始補加蔗糖， 對菌體生長可能會產生不同的影響。 因此，為了確定蔗糖的最佳補料時機，分別研究了在發酵過程進行到16、18、20 h 開始每隔2 小時間歇性流加蔗糖，補糖總量為80 g/L，分4 次補加到發酵罐中，結果如圖2 所示。

圖1 攪拌轉速對L-ASNase 分批發酵過程的影響Fig. 1 Influence of stirring speed on the production of L-asparaginase in batch fermentation

表1 不同攪拌轉速下L-ASNase 分批發酵過程參數比較Table 1 Comparison of fermentation parameters among batches with different stirring speed conditions

圖2 補料時間對L-ASNase 補料分批發酵過程的影響Fig. 2 Influence of feeding time on the production of L-asparaginase in fed-batch fermentation

當發酵過程進行到16 h 時發酵液中的蔗糖質量濃度減少到10 g/L 左右， 此時溶氧還沒反彈，菌體正處于對數生長期，對蔗糖的消耗速度較快。 由圖2（b）可知，在此時補加蔗糖能很好的滿足菌體對蔗糖的需求， 菌體OD600進一步提高， 在28 h 達到60.3，和分批發酵相比提高了12.1%，酶活在44 h 達到972.1 U/mL，和分批發酵相比提高了14.3%。當發酵過程進行到18 h 時發酵液中的蔗糖質量濃度減少到4 g/L 左右，菌體對蔗糖的消耗速度和16 h 相比減小很多。 在此時開始補加蔗糖（圖2（c）），和分批發酵相比，OD600和酶活分別提高了5.1%、11.8%。當發酵過程進行到20 h 時發酵液中的蔗糖質量濃度僅剩1 g/L 左右，菌體開始進入穩定期，在此時開始補加蔗糖（圖2（d）），由于補料太遲，菌體所需的能量不能及時供給，OD600無明顯提高， 酶活僅提高了9.9%。 故選擇在16 h 開始補加蔗糖。

2.3 補料培養基組成對L-ASNase 補料分批發酵過程的影響

由補料時間結果可知， 在16 h 單一補加蔗糖，菌體量雖然有所提高，但提高幅度不大。 菌體生長還需要其他營養物質，僅僅補加碳源對提高菌體量和酶產量作用有限[14]。 故進一步研究了補料培養基組成對L-ASNase 補料分批發酵過程的影響。

首先在搖瓶水平上通過蔗糖、酵母蛋白胨和玉米漿的不同組合研究補料培養基組成對B.subtilis/ASNΔ25/B2 產L-ASNase 的影響， 以此作為在發酵罐上進一步放大的基礎，結果如圖3（a）所示。 和對照組相比，實驗組的OD600和酶活均有提高，說明補加培養基對菌體生長和產酶有利。 比較實驗組可知，補加蔗糖的同時再補加酵母蛋白胨或玉米漿效果都比單一補加蔗糖更好，三者一起補加時效果最好，這可能是因為酵母蛋白胨和玉米漿中除了含有菌體生長需要的營養物質外還含有產酶的前體物質[18]。 和對照組相比，三者一起補加使OD600提高了45.5%，酶活提高了43.8%。 故在3 L 發酵罐上選擇同時補加蔗糖、酵母蛋白胨和玉米漿進行補料分批發酵，發酵過程曲線如圖3（b）所示。OD600在32 h 達到91.1，酶活在48 h 達到1136.9 U/mL，和16 h 單一補加蔗糖相比，分別提高了51.1%、17%。

2.4 補料量對L-ASNase 補料分批發酵過程的影響

由上述結果可知，同時補加蔗糖、酵母蛋白胨和玉米漿，OD600和酶活都有較大的提高， 如果延長補料時間， 繼續補加新鮮培養基，OD600和酶活可能會進一步提高，故有必要對培養基補加量進行研究。

圖3 補料培養基組成對L-ASNase 補料分批發酵過程影響Fig. 3 Influence of composition of feed medium on the production of L-asparaginase in fed-batch fermentation

在發酵過程進行到16 h 時開始每隔2 小時補加一次蔗糖，分別補加4、6、8 次，蔗糖補加總量分別為80、120、160 g/L。在補加蔗糖的同時，按發酵培養基中的蔗糖、 酵母蛋白胨和玉米漿的比例，以32 mL/h 恒速補加酵母蛋白胨和玉米漿混合氮源，實驗結果如圖4 所示。 當蔗糖補加量為80 g/L 時，在消耗蔗糖的同時OD600逐漸增加， 發酵32 h 時蔗糖耗盡，OD600在32 h 達到最大值91.1，L-ASNase 酶活在48 h 達到最大為1136.9 U/mL。 當蔗糖補加量為120 g/L 時，發酵40 h 蔗糖耗盡，在細胞耗糖的同時OD600逐漸平穩增加， 在40 h 達到最大值119.7，酶活也隨著菌體生長不斷增加，在48 h 達到最大值1279.6 U/mL。當蔗糖補加量增加到160 g/L 時，蔗糖在44 h 才消耗完全，OD600在40 h 達到最大為121.6， 和補糖總量120 g/L 時所能達到的OD600接近，L-ASNase 酶活在48 h 達到最大值1294.6 U/mL。雖然酶活最大值比補糖總量120 g/L 時有少量增加，但不是很顯著，且消耗了更多的原料。 故為了節約成本，選擇蔗糖補加量為120 g/L。

圖4 補料量對L-ASNase 補料分批發酵過程的影響Fig. 4 Influence of feeding quantity on the production of L-asparaginase in fed-batch fermentation

2.5 流加方式對L-ASNase 補料分批發酵過程的影響

碳源的流加方式對補料分批發酵過程有著重要影響。 非反饋式流加主要包括脈沖式流加、恒速流加、指數流加和間歇性流加等[19]，不同的產物、不同的菌體適合不同的補料策略。 為了進一步研究蔗糖流加方式對補料分批發酵的影響，在間歇性流加的結果之上采用恒速流加和指數流加進行發酵培養，發酵過程曲線如圖5 所示。

由圖5（b）可知，當在16～28 h 以18.75 mL/h 平均流速恒速流加蔗糖時，細胞OD600一直平穩增加，在44 h 達到最大值128.6，L-ASNase 酶活在48 h達到最大值1413.6 U/mL，和間歇性流加（圖5（a））相比，酶活進一步提高。 由圖5（c）可知，當發酵16 h時開始指數流加蔗糖時， 菌體OD600在32 h 達到最大值81.2，L-ASNase 酶活在44 h 達到最大值1048.9 U/mL，和間歇性流加相比酶活下降。 這可能是因為蔗糖并非發酵培養基中的唯一碳源，且流加速率是通過理論計算得到的[20]，導致蔗糖沒能及時消耗，使菌體濃度減小，干擾了菌體的生長代謝，故最終沒有達到較好的效果。 不同流加方式發酵過程參數如表2 所示， 和間歇性流加相比， 恒速流加OD600、酶活、生產強度都進一步提高。 指數流加雖然發酵周期較短，但是蔗糖轉化率、OD600和酶活較低，導致其生產強度也較低。 在補料量相同的情況下，恒速流加蔗糖能取得更高的產酶量、底物轉化率和生產強度，故最終采用恒速流加。

圖5 流加方式對L-ASNase 補料分批發酵過程的影響Fig. 5 Influence of feeding mode on the production of L-asparaginase in fed-batch fermentation

表2 不同流加方式L-ASNase 補料分批發酵過程參數比較Table 2 Comparison of fermentation parameters among batches on different feeding mode

3結 語

在B. subtilis/ASNΔ25/B2 產L-ASNase 發酵過程中， 通過兩階段控制攪拌轉速的培養策略即0 ～8 h 控制攪拌轉速700 r/min，8 h 以后攪拌轉速恒定在900 r/min，使菌體OD600、酶活和生產強度與恒定轉速600 r/min 相比， 分別提高了18.8%、31.9%、46.6%。 通過對補料時間、補料培養基組成、補料量、蔗糖流加方式的研究，得出：當在16～28 h 以平均流速18.75 mL/h 恒速流加蔗糖、 以平均流速32 mL/h恒速流加酵母蛋白胨和玉米漿混合氮源時效果最好，OD600最高達到128.6，L-ASNase 酶活在48 h 達到最大1413.6 U/mL。和分批發酵相比，提高幅度高達66.2%。 和Khushoo[9]（870 U/mL）、 龍 水 清[10]（112.61 U/mL）、Chityala[11]（525.98 U/mL）等人報道的L-ASNase 產量相比，本研究的L-ASNase 最終產量高于目前報道的水平， 為實現國內L-ASNase 工業化生產提供了數據支撐。