拮抗性芽孢桿菌的篩選及發酵培養基優化

曹睿琪，杜華，孫天成

（南京工業大學，江蘇南京 211816）

人類在生態圈中的活動日益頻繁，過度使用β內酰胺類、喹諾酮類等傳統抗生素對抗細菌、真菌等有害微生物，導致部分有害微生物通過自身進化產生強耐藥性。所以打破固有思維，探尋具有拮抗作用的新型抗生素在抗生素發展中顯得至關重要。在眾多的革蘭氏陽性菌中，芽孢桿菌因為能夠自產內生孢子具有拮抗作用而獲得越來越多的關注。自美國科學家Jonson[1]在人體組織中分離出地衣芽孢桿菌后，作為拮抗性芽孢桿菌屬中家族成員之一的地衣芽孢桿菌以其廣譜、高效的抑菌特性成為生物拮抗領域的研究熱點。因此以活化地衣芽孢桿菌為基礎，將枯草芽孢桿菌、里氏木霉、大腸桿菌作為指示菌，對地衣芽孢桿菌進行篩選；同時用濾紙片法測定抑菌圈直徑大小，分析拮抗性芽孢桿菌的抑菌性能；并采用單因素變量法，分析發酵培養基不同成分對拮抗性地衣芽孢桿菌的拮抗性能影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

指示菌：枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，里氏木霉；待篩菌：地衣芽孢桿菌。菌種來源：南京工業大學國家生化工程技術研究中心。

1.1.2 細菌培養基

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 mL，NaCl 5 g，淀粉30 g，濃度為3.08%濃度的MgSO410 mL，水1 000 mL[2]。

1.1.3 真菌PDA培養基

馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水1 000 mL，調至自然pH。

1.1.4 待篩菌發酵培養基

濃度為1.5%的葡萄糖，3%的蛋白胨，0.15%的CaCl2等，調pH值至中性，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器設備

ZHWY-2102C恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；YX280D高壓滅菌鍋，上海海埃塞克生物科技有限公司；OMP200A電子天平，上海第二天平儀器廠；HI9214 pH測定儀，蘇州海云天儀器儀表有限公司；500-182-30游標卡尺，上海辛睿電器科技有限公司；SP-756P紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

移液槍轉移100～300 μL菌液至平板中，涂布，完成后灼燒涂布棒，再進行三區劃線；殺死接種環多余菌，最后打開三區劃線平板，取一個單菌落，再打開LB培養基，中間劃線后進行密集劃線。

1.3.2 種子液培養

取培養好的斜面，將密集劃線后長好菌的平板放至室溫，同時將種子液放入超凈臺進行紫外滅菌。

1.3.3 發酵培養

對枯草桿菌、大腸桿菌采用細菌培養基進行發酵培養，里氏木霉采用真菌發酵培養基，待篩芽孢桿菌發酵培養基見1.1.4。

1.3.4 芽孢桿菌篩選

1.3.4.1 指示平板

分別將枯草芽孢桿菌，大腸桿菌和里氏木霉菌液加入到標準平板中，再分別加入3種指示菌的培養基20 mL，輕微振蕩，水平放置后制備成指示菌平板[3]。

1.3.4.2 初篩

先以枯草芽孢桿菌為指示菌對地衣芽孢桿菌進行初篩，取菌株上清液過0.22 μm的濾膜，選擇輕薄的紙片，將這些紙片裁剪成方形，蘸取待測地衣芽孢桿菌發酵液，將紙片均勻貼在指示平板的表面，把濾紙片周圍明顯產生透明抑菌圈的地衣芽孢桿菌分別編號為H29、28、30、31、32，并用游標卡尺測定5種菌株抑菌圈直徑大小，篩選出拮抗作用最強的地衣芽孢桿菌。

1.3.4.3 復篩

將初篩得出的拮抗作用最強的拮抗性地衣芽孢桿菌菌株用接種環挑出，再分別用枯草芽孢桿菌、里氏木霉、大腸桿菌作為指示菌來觀察抑菌圈透明圈，并用游標卡尺測量大小，驗證該菌株是否具有普遍抗菌活性。

1.3.5 發酵培養基營養成分優化

對發酵培養基進行單因素實驗，將復篩選出的拮抗性地衣芽孢桿菌于斜面活化，再接種后對發酵培養基營養成分進行單因素實驗，繼續采用濾紙片法測定產抗菌肽的該地衣芽孢桿菌的抑菌圈直徑[4]。

2 結果與分析

2.1 抑菌圈直徑測定

如表1所示，初篩以枯草芽孢桿菌為指示菌，用游標卡尺對編號H29、28、30、31、32的5種菌株進行抑菌圈大小測量，結果32＞H29＞28＞31＞30，最大抑菌圈直徑達到18.56 mm。如表2所示，復篩對32菌株進行純培養，再以枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、里氏木霉為指示菌，測定32菌株的抑菌圈大小。復篩結果表明，以枯草芽孢桿菌為指示菌時，32地衣芽孢桿菌抗菌能力最強，抑菌圈大小可達18.57 mm。

2.2 單因素實驗結果

復篩結果表明，以枯草芽孢桿菌為指示菌，地衣芽孢桿菌32抑菌圈大小最大，即產抗菌肽能力最強，所以重點對地衣芽孢桿菌32進行單因素實驗。以C源（葡萄糖）為單變量，設置葡萄糖濃度為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%[4]，N源（蛋白胨）保持為3%，無機鹽（CaCl2）保持為0.15%，配制5瓶培養基，再以枯草芽孢桿菌為指示菌，重復濾紙片法進行抑菌圈測定，如圖1所示為抑菌圈大小。當葡萄糖量為1.0%時，地衣芽孢桿菌32抑菌圈直徑最大，拮抗性能最強，且拮抗性能隨葡萄糖濃度增大而下降。

表1 地衣芽孢桿菌抑菌圈測定結果（初篩）

表2 地衣芽孢桿菌抑菌圈測定結果（復篩）

圖1 葡萄糖濃度對拮抗性能的影響

以N源（蛋白胨）為單變量，設置蛋白胨濃度為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%，保持C源1.0%、無機鹽0.15%，配制5瓶培養基，分別得到抑菌圈大小如圖2所示。當蛋白胨添加量為3.0%時，地衣芽孢桿菌32抑菌圈直徑最大，拮抗性能最強。當蛋白胨濃度為2.0%～3.0%時，拮抗性能逐漸增大，而蛋白胨濃度為3.0%～4.0%時，拮抗性能逐漸減小。

以無機鹽（CaCl2）為單變量，設置無機鹽濃度為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%，保持C源1.0%、N源3.0%，配制5瓶培養基，分別得到抑菌圈大小如圖3所示。當CaCl2添加量為0.15%時，地衣芽孢桿菌32抑菌圈直徑最大，拮抗性能最強。當蛋白胨濃度為0.05%～0.15%時，拮抗性能逐漸增大，而蛋白胨濃度為0.15%～0.25%時，拮抗性能逐漸減小。

圖2 蛋白胨濃度對拮抗性能的影響

圖3 CaCl2添加量對拮抗性能的影響

3 結論

芽孢桿菌屬中地衣芽孢桿菌具有良好的拮抗性能，在以枯草芽孢桿菌為指示菌進行初篩條件下，編號H29、28、30、31、32菌株的拮抗性能也不同。復篩時以枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、里氏木霉作為指示菌對菌株32測定抑菌圈大小，發現枯草桿菌為指示菌時抑菌圈最大。單因素實驗表明，葡萄糖添加量為1%、蛋白胨添加量為3%、CaCl2添加量為0.15%時，地衣芽孢桿菌32抑菌圈直徑最大。