沙門(mén)氏菌烈性噬菌體的分離鑒定與生物學(xué)特性分析

仇笑笑

（山西醫(yī)科大學(xué)晉祠學(xué)院，山西太原 030025）

臨床中沙門(mén)菌是一種廣泛分布在自然界中的革蘭氏陰性桿菌，可導(dǎo)致貝類(lèi)、羊、豬、雞、鴨等多種動(dòng)物和人患病[1]。目前多采用抗生素抑制沙門(mén)菌增殖，但近年來(lái)隨著抗生素藥品的濫用，沙門(mén)菌耐藥性顯著提升，給國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，沙門(mén)菌作為一種常見(jiàn)的食源性致病菌，對(duì)人類(lèi)身體健康也產(chǎn)生了一定程度的影響[2]。臨床中噬菌體能夠特異性侵染細(xì)菌，通過(guò)自身特定配體同細(xì)菌表層特定受體相結(jié)合的途徑裂解細(xì)菌，從而抑制病菌增殖，且沙門(mén)菌噬菌體僅會(huì)影響沙門(mén)菌合成，并不會(huì)對(duì)正常菌群產(chǎn)生不良影響，不受細(xì)菌耐藥性的制約，屬于天然、安全的抑菌劑[3-4]。為了探討抗沙門(mén)菌的有效方法，利用噬菌體治療細(xì)菌感染，就沙門(mén)菌烈性噬菌體的分離鑒定與生物學(xué)特性進(jìn)行如下探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選自臨病死雞中分離出的沙門(mén)氏菌菌株，墊料、糞便均源于山西省尖草坪區(qū)、長(zhǎng)子縣、高平市、臨猗縣和壺關(guān)縣等地商品肉雞場(chǎng)。

日立Hitachi H-9500透射電子顯微鏡；LB培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于北京陸橋公司；Beckman Coulter Avanti J-26S離心機(jī)；蘇瑞電子設(shè)備(北京)有限公司提供的DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱；Millex-GV SLGVX13NL 1000細(xì)菌過(guò)濾器；上海知楚儀器有限公司提供的ZQZY-88BV型全溫振蕩培養(yǎng)箱。全部研究材料和用品均處于有效期內(nèi)，器械性能正常。

1.2 方法

1.2.1 處理樣本

采集雞糞和墊料30 g，加入200 mL無(wú)菌生理鹽水內(nèi)，確保浸泡充分，自然沉降240 min后取上清液，12000 r/min離心處理15 min，再使用濾器過(guò)濾（0.22 μm），以濾液作為分離噬菌體的母液。

1.2.2 菌種復(fù)蘇與菌懸液制備

復(fù)蘇冷凍保存的沙門(mén)菌，挑取生長(zhǎng)菌落轉(zhuǎn)移至LB肉湯內(nèi)，放置在全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，制備好菌懸液，備用。

1.2.3 采用雙層平板法分離噬菌體

在操作過(guò)程中取1.2.1中的母液3 mL和增殖后的沙門(mén)菌菌懸液200 μL，均勻混合，震蕩培養(yǎng)，維持溫度37 ℃，過(guò)夜后采集培養(yǎng)后的增殖液在10 000 r/min條件下進(jìn)行離心處理5 min，再使用細(xì)菌濾器（0.22 μm）進(jìn)行過(guò)濾處理。取濾液200 μL與菌懸液100 μL均勻混合后，放置在37 ℃溫箱內(nèi)孵育5 min。將混合液添加至融化后冷卻到45 ℃左右的含瓊脂（0.7%）LB上層瓊脂內(nèi)，均勻混合，將上層瓊脂倒進(jìn)下層營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，等待凝固，再放置在溫箱內(nèi)培養(yǎng)8～10 h，溫度37 ℃，觀察噬菌斑生長(zhǎng)情況。

1.2.4 純化噬菌體

使用無(wú)菌鑷子扣取培養(yǎng)基內(nèi)的單個(gè)噬菌斑，將其放置在裝有1 mL生理鹽水的無(wú)菌離心管，水浴30 min，溫度40 ℃，待水浴完畢立即在10 000 r/min條件下予以離心處理5 min，適度稀釋浸出液，將其與宿主菌鋪在雙層平板上，重復(fù)扣取單個(gè)噬菌斑實(shí)施純化操作，直至獲取形態(tài)、大小均一的蝕斑為止，共純化7代。

1.2.5 測(cè)定噬菌體效價(jià)

使用液體增值法測(cè)定效價(jià)，扣取單個(gè)噬菌斑后制備噬菌體浸出液，采集浸出液500 μL和宿主菌懸液200 μL，與LB肉湯均勻混合后震蕩培養(yǎng)，溫度37 ℃。取增值液在10 000 r/min條件下進(jìn)行離心處理5 min，適度稀釋后采集200 μL并與宿主菌100 μL鋪雙層平板進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。

1.2.6 測(cè)定噬菌體裂解譜

使用點(diǎn)樣法進(jìn)行檢測(cè)，采集待測(cè)菌懸液100 μL，轉(zhuǎn)移至瓊脂平板上，使用無(wú)菌棉簽涂勻，確認(rèn)菌液吸收完全后取噬菌體增值液2.5 μL，點(diǎn)涂至涂好菌的瓊脂培養(yǎng)基上，確認(rèn)噬菌體增值液被完全吸收后，將瓊脂培養(yǎng)基放置在溫箱內(nèi)孵育10 h，溫度37 ℃。

1.2.7 觀察噬菌體形態(tài)

取15 μL噬菌體增值液，添加至微孔銅網(wǎng)上進(jìn)行自然沉降，15 min后借助濾紙吸收多余液體，再滴加2%磷鎢酸10 μL實(shí)施染色處理，使用濾紙吸除多余液體，自然干燥后利用電鏡觀察噬菌體形態(tài)。

1.2.8 噬菌體溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)

取噬菌體增值液150 μL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，放置在 40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和 80 ℃的水浴中，掌握水浴作用20 min、40 min和60 min的效價(jià)變化，各溫度梯度重復(fù)2次，觀察噬菌體效價(jià)在不同溫度梯度中的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體分離結(jié)果

經(jīng)本次實(shí)驗(yàn)，成功分離到噬菌體1株，命名為CR5，經(jīng)過(guò)7代純化處理后，通過(guò)增殖進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)效價(jià)為109PFU/mL。

2.2 噬菌體裂解譜的測(cè)定

CR5可成功裂解實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存的33株沙門(mén)菌中的17株，屬于寬裂解譜噬菌體。

2.3 噬菌體電鏡觀察

經(jīng)透射電鏡可清晰觀察到噬菌體CR5由多平面體頭部及細(xì)長(zhǎng)尾部構(gòu)成，頭部呈六邊形，直徑約為50 nm，尾部長(zhǎng)度約為110 nm，詳見(jiàn)圖1。

2.4 噬菌體溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

觀察噬菌體效價(jià)在不同溫度梯度中的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噬菌體CR5效價(jià)隨溫度變化會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，具體情況如下：在40 ℃作用1 h后，噬菌體CR5仍可維持原有活性，在50 ℃、60 ℃狀態(tài)中20 min后效價(jià)下降，但仍可達(dá)到109PFU/mL；在70 ℃狀態(tài)下20 min后，CR5效價(jià)快速下降，降至106PFU/mL，在作用1 h后效價(jià)降至25 PFU/mL；在80 ℃狀態(tài)中20 min后即完全失活。溫度對(duì)噬菌體CR5的影響見(jiàn)圖2。

圖1 噬菌體CR5電鏡下形態(tài)

圖2 噬菌體CR5的熱穩(wěn)定性

3 討論

近年來(lái)，多重耐藥沙門(mén)菌在全球各地均有報(bào)道，因此有效防控沙門(mén)菌感染已成為養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)關(guān)注的重要問(wèn)題，相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，噬菌體可有效抑制沙門(mén)菌感染，與抗生素比較無(wú)耐藥性缺陷，可依賴(lài)宿主菌完成復(fù)制，具有使用劑量小、專(zhuān)一性強(qiáng)、對(duì)正常菌群副作用低的優(yōu)勢(shì)[5]。噬菌體在自然環(huán)境中分布廣泛，為人類(lèi)提供豐富抗菌資源庫(kù)，目前被分離、利用的噬菌體較少。有學(xué)者[6]研究后發(fā)現(xiàn)，噬菌體能夠在宿主菌上吸附，并在宿主菌內(nèi)部生長(zhǎng)、增殖，對(duì)耐藥宿主菌進(jìn)行裂解，為沙門(mén)菌臨床抗感染治療提供了思路，具有重要的參考意義。本次研究中分離得到的噬菌體CR5效價(jià)達(dá)到109PFU/mL，且電鏡觀察結(jié)果提示，噬菌體CR5呈長(zhǎng)尾狀。分析后可知，雙層平板上裂解性噬菌體的蝕斑邊緣清晰、形狀規(guī)則、透亮，能夠清晰觀察噬菌體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)噬菌體CR5由頭部和尾部?jī)刹糠纸M成，屬于長(zhǎng)尾科。而裂解性噬菌體能夠通過(guò)裂解宿主菌細(xì)胞，加快細(xì)菌死亡，在致病菌防控中發(fā)揮著積極的作用。本次分離得到的噬菌體CR5對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的33株沙門(mén)菌中的17株進(jìn)行了成功裂解，裂解性較好，但仍有部分沙門(mén)菌未得到裂解，提示CR5僅能夠裂解部分種類(lèi)的沙門(mén)菌，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

江艷華[7]對(duì)分離到的一株沙門(mén)菌噬菌體進(jìn)行生物學(xué)特性分析后發(fā)現(xiàn)，噬菌體具有較好的溫度耐受性，可逐漸降低宿主菌數(shù)目，能夠作為生物抑菌劑防控沙門(mén)菌感染。陳義寶等[8]實(shí)踐后發(fā)現(xiàn)，使用雙層平板法篩選、純化沙門(mén)菌噬菌體，并利用電鏡觀察噬菌體形態(tài)，可了解沙門(mén)菌噬菌體的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)該噬菌體對(duì)不同溫度均具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，裂菌效果良好，可作為抗沙門(mén)菌制劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)。噬菌體CR5不同溫度下的活性試驗(yàn)證實(shí)該種噬菌體具有較好的溫度耐受性，在低溫環(huán)境中可有效降低宿主菌數(shù)量，在較高溫度條件下（40～60 ℃）可于一定時(shí)間內(nèi)（1 h）降低宿主菌數(shù)目，之后受殘留宿主菌繁殖速度超過(guò)噬菌體裂解速度因素影響，導(dǎo)致抑菌效果受限。因此在宿主菌處于抑制條件時(shí)具有良好的裂菌效果，臨床中可通過(guò)調(diào)控溫度與聯(lián)合使用其他抗菌制劑的方式，增強(qiáng)抑菌效果。

4 結(jié)論

對(duì)分離到的噬菌體實(shí)施純化、裂解譜檢測(cè)、效價(jià)檢測(cè)、電鏡形態(tài)觀察后發(fā)現(xiàn)，沙門(mén)菌噬菌體溫度耐受性較好，屬于一種長(zhǎng)尾科、強(qiáng)裂解性噬菌體，能夠有效發(fā)揮抑制沙門(mén)菌的效用，具有積極的應(yīng)用意義。