海藻渣改良栽培料對平菇多糖產量影響的研究

王盟星，朱紅薇，張琳，黃樂，秦益民

（1.嘉興學院生物與化學工程學院，浙江嘉興 314001；2.農業農村部海藻類肥料重點實驗室，山東青島 266400；3.海藻活性物質國家重點實驗室，山東青島 266400）

平菇是廣受大家喜愛的一種食物，不僅擁有良好的口感而且營養豐富，其中含有多糖、氨基酸、維生素等對人體有益的成分[1-4]。多糖（polysaccharide）是由糖苷鍵結合的糖鏈，至少由10個以上單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，是可以通過口服的功能性食品，不僅對人體有益，同時也具備很多臨床作用[5-6]。

浙江省等沿海城市，海藻資源豐富。海藻渣則是提取海藻內海藻酸、甘露醇、碘等產品的副產物，排放到水中會與水形成膠性粘稠物，造成水體污染[7-9]。海藻渣富含蛋白質、粗纖維、微量元素和少量的糖、粗脂肪等可適用于平菇栽培，如果能夠提高食用菌品質，將具有重要的經濟和社會價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

高平58（Pleurotus ostreatus）,本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

配制 3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS），AR分析純；0.01g/mL羧甲基纖維素鈉水溶液（CMC），AR分析純；1 mmol/L ABTS溶液，AR分析純；pH=4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，AR分析純（濟南鑫達化工有限公司）；海藻渣（青島明月提供）。

1.1.3 主要儀器

UV-1100紫外分光光度計(濟南千司生物技術有限公司)；SBA1243電子分析天平（哈爾濱德遠科技開發有限公司）；Eppendorf 5810R 離心機（深圳市德優平科技有限公司）；VS-130超凈臺（成都宜恒實驗儀器有限公司）；DVG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海巨為儀器設備有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配置及菌種活化

制備PDA培養基，將錐形瓶中培養基融化，倒入無菌平板，待其凝固。用打孔器在普通菌種平板上打出餅狀菌種，用鑷子取出放入凝固后的PDA培養基上，放入37 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2.2 栽培料配置

栽培基質以棉籽殼培養基為基礎，加入海藻渣，其輔料配比如表1所示。

拌勻培養料的輔料，加入少量去離子水，靜置發酵24 h，調節pH至中性；水分調節至用手緊握培養料之間有水珠滲出即可。分裝至200 mL玻璃瓶中，在栽培料中間打一個2～3 cm深的接種孔，放入高壓滅菌鍋，121 ℃滅菌2 h，室溫冷卻。

1.2.3 接種及出菇管理

將活化后的菌種接種于栽培料中，瓶裝栽培料置于28 ℃環境中，恒溫培養至菌絲長滿整個栽培料，打開瓶蓋，將室溫降至20～25 ℃，促進菌絲扭結。保持一定的濕度及栽培室內的空氣流動，有一定的散射光照射。

1.2.4 多糖提取工藝優化

將烘干至恒重的子實體粉碎、過60目篩，按固液比（g∶mL）1∶15、1∶20、1∶25量取菌粉2 g及蒸餾水所需用量于錐形瓶中（每梯度各3瓶），分別在60 ℃、70 ℃、80 ℃下熱水浸提1 h、2 h、3 h后抽濾、加入3倍體積的80%乙醇溶液搖勻、靜置過夜。

1.2.5 多糖溶液的配制與測定

將靜置過夜的提取液在4 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀用乙醇反復洗滌3次后放入1 000 mL容量瓶中充分溶解，取1 mL溶解后的多糖溶液于試管中，加入1 mL 6%的苯酚溶液，搖勻，緩慢加入5 mL濃硫酸后在25 ℃水浴中恒溫保持30 min后取出。將配置好的溶液裝于石英比色皿中，在488 nm處測定紫外吸收值。

1.2.6 粗酶液的提取

對菌菇廢渣的自然pH進行測定，選取自然pH附近的緩沖溶液作為提取液。每1 kg廢渣用1 L的提取液浸泡，靜置過夜。將靜置過夜的栽培料浸取液用3層濾網過濾，將濾液置于離心管中于4 ℃下9 000 r/min離心5 min，取上清液即為粗酶液。

1.2.7 酶活的測定

取兩支試管，一支加入3 mL蒸餾水，一支加入1 mL粗酶液、2 mL過氧化氫，加完后隨即計時，將反應液迅速加入石英比色杯中，在420 nm處每30 s記錄一次，測定3 min之內吸光值的變化量，以每分鐘吸光值減小0.1為一個酶活力單位[10-12]。

表1 栽培料培養基配比

取5支試管分別加入4 mL CMC，50 ℃水浴3 min，取出后加入稀釋50倍的粗酶液1 mL。繼續置于50 ℃水浴30 min后取出立即加入5 mL DNS，沸水浴5 min。待試管冷卻至室溫后測定530 nm處紫外吸收值，重復多次實驗，計算每組纖維素酶活力單位數值[13-16]。

2 結果與討論

2.1 食用菌生長情況

由圖1可知，在相同的生長條件下，菌絲隨著海藻渣添加量的增加生長速率先增加后減小，由此可以說明適量的海藻渣可以縮短菌絲長滿玻璃瓶的時間，促進菌絲的生長。從圖2可以看出菌絲潔白、濃密、粗壯且整齊，長勢優良。海藻渣比例不同，對菌絲生長的影響也不相同。總體來看，適量的海藻渣有助于菌絲的生長，這可能是因為海藻渣中含有的營養物質適合菌絲生長，當海藻渣量較多時，由于海藻渣容易結塊使得栽培料通氣性差，不適宜菌絲的生長。

圖1 菌絲生長圖

圖2 出菇過程圖

2.2 多糖提取工藝優化結果

2.2.1 響應面分析

如表2所示，通過實驗因素水平的設置及實驗的驗證，采用響應面分析法即非線性擬合方法，確定出多糖提取工藝為：提取時間3 h，水浴溫度為60 ℃，固液比為1∶25，該模型預測指導性很強，可靠性強。

表2 實驗因素水平表

2.2.2 不同比例栽培料對平菇多糖含量的影響

由表3可知，當海藻渣、棉籽殼比例為5∶5時，平菇子實體多糖產率最高。同時，平菇子實體多糖的產率隨著海藻渣添加量的增加先增大后減小?？赡苁请S著海藻渣的添加，粗纖維含量升高促進了纖維素酶活性的提高，加速了纖維素的分解，促進子實體的吸收。但當海藻渣過多時，海藻渣容易結塊，不利于海藻渣內纖維素的分解及子實體的吸收。

表3 多糖產量

2.2.3 不同比例栽培料對平菇酶活的影響

如圖3多組重復檢測數據結果顯示，當海藻渣、棉籽殼比例為7∶3時，平菇菌絲體內過氧化氫酶活及纖維素酶活性最高，且與傳統栽培料栽培的平菇菌絲體內酶活性相近。此外，隨著海藻渣加入量的增多，菌絲體內纖維素酶活性呈現上升趨勢，該現象與菌絲體中過氧化氫酶活性變化相符?？赡苁怯捎诤Ｔ逶鼉雀缓拇掷w維沒有棉籽殼中的含量多，所以當海藻渣、棉籽殼為1∶9時纖維素酶活性較低，然而隨著海藻渣添加，體系內纖維素不斷增多，促進了纖維素酶活性的提高。

圖3 過氧化氫酶和纖維素酶活性檢測結果

3 結論

當海藻渣、棉籽殼比例為5∶5時，平菇菌絲蔓延速度最快，且平菇子實體多糖含量高達14.84%，適量海藻渣的加入對平菇菌絲發育、子實體形成過程具有促進作用；當海藻渣、棉籽殼比例為7∶3時，平菇菌絲中過氧化氫酶及纖維素酶活性最高，且隨著海藻渣量的增加，兩種酶活均呈現出上升趨勢，但酶活性與多糖產量之間沒有協同關系，說明過氧化氫酶及纖維素酶不是平菇產多糖的主要酶類；實驗只測了2種特殊的胞外酶，關于平菇多糖產量是否與其它胞外酶有關以及具體的作用機制有待進一步研究。