濁度法在金黃色葡萄球菌體外藥物敏感性試驗及耐藥性分析中的應用

高鐸，孔繁雪，韓鐫竹，武鳳嬌，郭玉翠，李欣南*

（1.遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧沈陽110000；2.沈陽藥科大學，遼寧沈陽117004）

抗生素是目前治療細菌感染的主要藥物，其出現和使用為人類健康做出了不可磨滅的貢獻，對動物疾病的預防與控制作用同樣功不可沒。但不規范用藥則會引發畜禽的群體性危害，造成獸藥殘留超標、產生細菌耐藥性和畜禽產品質量安全等問題。為了滿足人類對動物性食品不斷增長的需求，人們在畜禽養殖過程中常常大量使用抗生素類藥物來預防動物性疾病并促進生長。抗生素的殘留使得一些動物體內的細菌常暴露在抗生素環境中，體內的耐藥菌株將會得到選擇性增殖，使得抗生素的治療效果下降[1-2]。

金黃色葡萄球菌屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重感染，是臨床上重要的致病菌，特別是超級細菌-耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的出現及其耐藥性的快速增長，使其成為全球內感染的首要病原菌。金黃色葡萄球菌常引起兩類疾病：（1）化膿性疾病，主要引起動物的乳房炎、關節炎等，可通過動物傳遞給人類；（2）毒素性疾病，會引起人和動物的中毒性嘔吐等，嚴重威脅人類的食品安全和公共衛生[3-6]。

微生物比濁法能直觀地反應抗生素總的抗菌能力[7-8]，因此利用該原理，本文選擇了慶大霉素、紅霉素、氧氟沙星3種不同類型的藥物，實時測定并繪制時間-吸光度抑菌生長曲線，以此分析3種藥物在不同濃度下、不同時間節點上與細菌相互作用的關系，旨在為藥效學的研究、解決細菌耐藥性及指導臨床合理使用抗生素提供數據和試驗參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213，購自北京蘭伯瑞生物技術有限責任公司；實驗菌株DX1、XNC22于養殖場中分離獲得。

1.2 儀器

CLASS Ⅱ生物安全柜，購自美國NUAIRE公司；全自動高壓滅菌器，購自日本三洋電器集團；恒溫培養箱，購自德國BINDER公司；VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統，購自BIOMERIEUX公司；WBS-100微生物比濁法測定儀，購自北京先驅威鋒技術開發公司。

1.3 培養基與材料

抗生素檢定培養基3號，購自北京中海生物科技有限公司；營養瓊脂，購自北京陸橋技術有限責任公司；革蘭氏陽性菌鑒定卡（GP鑒定卡），購自BIOMERIEUX公司；標準品購自中國獸醫藥品監察所或中國食品藥品檢定研究院。

1.4 方法

1.4.1 菌懸液的制備

根據美國臨床和實驗室標準化研究所（CLSI，Clinical and Laboratory Standards Institute ）對菌懸液濃度的要求[9]，來稀釋菌懸液。將保存的菌種接種于配制好的營養瓊脂培養基中，置于37℃培養箱中培養24h后取出待用，在生物安全柜中，用棉簽取單菌落于裝有0.85%滅菌生理鹽水的安瓿瓶中，用麥氏比濁儀將試驗菌液濃度調節為0.5麥氏（0.5麥氏菌懸液的濃度約為1.5×108cfu/mL），后進一步稀釋至5×105cfu/mL，備用。

1.4.2 儲備藥液的制備

將慶大霉素、紅霉素、氧氟沙星標準品分別溶解并稀釋成2048μg/mL的抗生素貯存液。配制的藥液以質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC?29213進行質控，其最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）值在CLSI允許的范圍內。

1.4.3 微量稀釋法-藥物敏感性試驗

采用CLSI指定的微量稀釋法，進行藥物敏感性實驗[9]。取稀釋至5×105cfu/mL濃度的菌液0.1mL分別加入含系列抗菌藥物溶液的板中，混勻使試管中最終抗菌藥物的濃度為原稀釋濃度的50%，并設置陽性對照和陰性對照。將加有菌液和抗菌藥物的板置37℃培養箱中培養18～20 h。觀察記錄結果，以無菌生長的最低抗菌藥物溶液的濃度為MIC值。判定標準參照CLSI標準，具體見表1，按判斷標準判斷被檢菌株的敏感性為敏感（S），中度敏感（I）或耐藥（R）。

1.4.4 濁度法-體外藥物敏感性試驗

根據質控菌和試驗菌的微量稀釋法-藥物敏感性試驗獲得的MIC值，分別用水稀釋成4個不同的藥物濃度，備用。向比濁管中按拉丁方排列加入配制好的系列濃度藥物1.00mL，再加入9.00mL適宜濃度的菌懸液，使菌液終濃度為5×105cfu/mL，藥物終濃度分別為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC。

表1 金黃色葡萄球菌藥敏判定標準和質控范圍

表2 不同藥物濃度拉丁方排列方式

將添加有不同濃度藥物、菌液混懸液的比濁管放入到WBS-100微生物比濁法測定儀中，培養溫度為37℃，監測間隔時間為30min，監測時長為16h，測定實時吸光度。試驗結束后通過不同時間節點的吸光度值使用Excel繪制其時間-吸光度抑菌生長曲線。

2 結果與分析

如表3所示，微量稀釋法-藥物敏感性試驗測得的MIC結果與濁度法測得的結果無顯著差異，但濁度法試驗為實時吸光值信號采集，獲得的結果可能更接近實際的MIC值，而通過時間-吸光度曲線進行MIC終點判讀則更直觀和準確。

如圖1所示，3種藥物的分離菌株生長曲線都是前期呈不斷增長的趨勢，到后期明顯逐漸下降，而質控菌株呈現增長的趨勢，下降趨勢不明顯；不論是分離菌株還是質控菌株，呈現的生長曲線的1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC曲線下面積不同；1/8MIC先于1/4MIC進入對數生長期，1/4MIC先于1/2MIC進入對數生長期；紅霉素、慶大霉素的分離菌1/2MIC先于質控菌1/2MIC進入對數生長期；氧氟沙星為快速殺菌劑，其1/2MIC進入對數生長期較紅霉素和慶大霉素早。紅霉素為時間依賴型抗生素，其抑菌時間比慶大霉素和氧氟沙星都要長。。

通過紅霉素、慶大霉素和氧氟沙星3種藥物的時間-抑菌生長曲線分析，可以發現金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度（1/2 MIC）的壓力下，其生長趨勢呈現了不同于理論設想的情況，可能并非是細菌抑制或殺死其生長量絕對值的一半。

表3 3種抗菌藥物對金黃色葡萄球菌的MIC

圖1 金黃色葡萄球菌在3種抗菌藥物作用下的時間-吸光度曲線

圖2 質控菌株ATCC29213在3種抗菌藥物作用下的時間-吸光度曲線

3 討論與結論

已有研究表明，亞抑菌濃度下細菌耐藥基因的水平傳播可能性增加，突變株數量大于野生株數量，還會形成生物膜，這些都可導致耐藥性的產生，而亞抑菌濃度的藥物壓力下，耐藥菌株還會被選擇性富集，因此亞抑菌濃度下細菌與藥物的作用關系很有研究價值[10-12]。不同藥物濃度下金黃色葡萄球菌進入對數生長期的時間有顯著差異，高濃度藥物下的金黃色葡萄球菌進入對數生長期較低濃度藥物有一定的延遲，目前還不明確金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度下是否會蓄積不同耐藥機制的耐藥菌株，即藥物壓力下快速進入對數期的細菌可能為獲得耐藥性的細菌。但也有研究證實，發生突變的高水平耐藥菌的適應性與其親本株相比大多數出現適應性下降[13]；耐藥金黃色葡萄球菌的生長曲線呈現先增長后減小的趨勢；濁度法下的時間-抑菌生長曲線可清楚地對不同依賴型藥物的抑菌殺菌時間進行可視化判定，慶大霉素、氧氟沙星為濃度依賴型，可見不同藥物濃度對細菌生長繁殖影響較大，而紅霉素為時間依賴型，隨著時間的延長，不同藥物濃度的抑菌時間均比慶大霉素、氧氟沙星長，提示時間依賴型藥物的抑菌時間均比濃度依賴型藥物長。

濁度法較微量稀釋法比較具有5點優勢：（1）濁度法可以進行實時監控，測定其實時吸光值，反映金黃色葡萄球菌生長的動態趨勢，微量稀釋法只能在第2 d觀察結果；（2）濁度法可以使用現有的濁度分析儀，實現自動化數據采集；（3）濁度法結合振搖培養，保證了藥物與細菌的充分作用；（4）濁度法終點判讀時更直觀；（5）濁度法可清楚地對不同依賴型藥物的抑菌殺菌時間進行可視化判定。

通過紅霉素、慶大霉素和氧氟沙星3種藥物的時間-抑菌生長曲線分析，金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度（1/2 MIC）的壓力下，可能并非是細菌抑制或殺死其生長量絕對值的一半；不同藥物濃度下金黃色葡萄球菌進入對數生長期的時間有顯著差異，高濃度藥物下的金黃色葡萄球菌進入對數生長期較低濃度藥物有一定的延遲；耐藥金黃色葡萄球菌的生長曲線呈現先增長后減小的趨勢；隨著時間的延長，不同藥物濃度的紅霉素抑菌時間均比慶大霉素、氧氟沙星長。