HPLC測定替米沙坦片含量方法學驗證

陳曉春，蔣玲，彭奎毓，張立仁，張朝俠

（江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，江蘇徐州 221004）

替米沙坦是一種口服非肽類血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，其脂溶性強，半衰期長，副作用較小，患者耐受性高，此外還可以選擇性的激動過氧化物酶增殖物激活受體，改變左心室肥厚、改善胰島素抵抗、保護血管內皮功能，是國內增長速度很快的沙坦類藥物。替米沙坦片由德國Beohringer Ingelheim公司研制開發，規格為40 mg/片和80 mg/片，于1999年首次在美國上市。替米沙坦半衰期為18～24 h，藥效作用時間可達35 h，可有效控制24 h血壓，符合1天1次的用藥標準[1]。本文建立一種快速、準確的高效液相色譜法，可有效測定替米沙坦片的含量，并對該方法進行驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1200 VWD高效液相色譜儀（安捷倫公司）； LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；XS105型電子分析天平（梅特勒-托利多國際有限公司）；Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，Inertsil?ODS-SP色譜柱。

替米沙坦對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號100629-150707；替米沙坦片，萬邦醫藥，批號16037021；色譜純甲醇（德國默克公司）、超純水、磷酸二氫銨（國藥集團）、磷酸（國藥集團）。

1.2 含量測定方法

日本藥典JP16第二增補本采用高效液相色譜法測定替米沙坦片含量；本研究依據日本藥典方法擬定高效液相色譜法測定本品含量，具體操作如下。

色譜條件：色譜柱（Inertsil?ODS-SP，4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為0.2%磷酸二氫銨溶液（用10%磷酸溶液調pH值至3.0）和甲醇，比例為30∶70；檢測波長為295 nm，柱溫為40 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，替米沙坦主峰約6 min。

系統適用性試驗：取對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，以替米沙坦峰計，理論塔板數不少于3 000，拖尾因子不超過2.0，對照品溶液重復進樣6針，以替米沙坦峰計相對標準偏差不得過1.0%。

供試品制備：取替米沙坦片不少于20片，研磨，取細粉適量（約相當于替米沙坦80 mg），加50%甲醇溶解并定容稀釋制成濃度為80 μg/mL的溶液。

對照品溶液制備：精密稱定替米沙坦對照品20 mg置于25 mL量瓶中，加10 mL的2%葡甲胺溶液和適量50%甲醇溶解并定容稀釋，搖勻，精密移取該溶液5 mL置于50 mL量瓶中，用50%甲醇定容，制成濃度為80 μg/mL的溶液。

1.3 方法學驗證

1.3.1 專屬性考察

原料溶液：按照對照品配制方法配制80 μg/mL替米沙坦的原料溶液。空白輔料溶液：按照處方比例配制空白輔料，稱取混合粉末約2片空白輔料重量后按照供試品溶液配制方法配制成空白輔料溶液。分別取溶劑、對照品溶液、原料溶液、空白輔料溶液和供試品溶液，按照高效液相色譜法采用PDA檢測器在190～450 nm波長處進行全波長掃描。

1.3.2 濾膜吸附試驗

將供試品儲備液（濃度為0.8 mg/mL）經0.45 μm微孔濾膜（有機系）過濾，取5 mL續濾液置50 mL量瓶，加溶劑稀釋至刻度，搖勻；同法制備離心樣品，即將濾膜處理換成離心處理（4 000 r/min，10 min）。將經濾膜和離心處理的供試品溶液注入高效液相色譜儀中，按照1.2中色譜條件進樣分析，記錄響應峰面積。

1.3.3 線性與范圍

精密稱定替米沙坦對照品約20 mg置于25 mL量瓶中，加0.2%葡甲胺溶液，振搖使溶解，精密量取續濾液0.5 mL、2.5mL、4 mL、5 mL、8 mL分別置于50 mL量瓶中，用溶劑定容至刻度，搖勻即得，精密量取各供試液10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。

1.3.4 重復性試驗

取本品（批號16037021）按照1.2中供試品制備方法，平行配制6份供試品溶液，進樣記錄色譜圖，按外標法計算替米沙坦片含量。

1.3.5 中間精密度試驗

不同人員按照重復性的方法，在不同時間、不同儀器對同一批供試品溶液進樣分析。

1.3.6 準確度（加樣回收率）

精密稱取替米沙坦原料約64 mg、80 mg、96 mg分別置100 mL量瓶中，再分別稱取空白輔料約2片量，加溶劑適量，超聲溶解15 min，放冷，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，經微孔濾膜（有機系0.45 μm）過濾即得，平行3份。按照含量測定項的方法，分別精密吸取配制好的對照品溶液和3種濃度（80%，100%，120%）的9份供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率及RSD值。

1.3.7 溶液穩定性

取重復性項下的對照品溶液、供試品溶液分別在0 h、1 h、2 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h 進樣分析。記錄色譜圖，計算峰面積，考察對照品溶液和供試品溶液放置過程中的穩定性，結果以峰面積計算RSD。

1.3.8 耐用性

取供試品和對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，分別在柱溫±5 ℃、波長±5 nm、流速±0.2 mL/min，流動相比例±3%，流動相pH±0.2條件下采用2種色譜柱（色譜柱 1：Inertsil?ODS-SP，4.6 mm×150 mm，5 μm；色譜柱 2：Agilent Eclipse XDB-C18，4.6 mm×150 mm，5 μm）進行試驗，記錄色譜圖。以替米沙坦峰計，理論塔板數不少于3 000，拖尾因子不超過2.0，對照品重復進樣6針，以替米沙坦峰計相對偏差不得超過1.0%。按外標法得到含量，計算RSD值，考察本法的耐用性。

1.3.9 供試品含量測定

按照上述含量方法，測定3批供試品（批號分別為16037011，16037021，16037181）中替米沙坦的含量。

2 試驗結果

2.1 專屬性考察結果

對照品溶液、原料溶液和供試品溶液中均在297 nm波長處有最大吸收，且主峰保留時間一致（如圖1、圖2所示），溶劑和空白輔料對替米沙坦峰無干擾，表明該方法專屬性較好。

圖1 對照品、供試品和原料紫外吸收圖譜

圖2 對照品、供試品和原料液相圖譜

2.2 濾膜吸附結果

濾膜吸附結果如表1所示，結果表明分別經過濾和離心的供試品峰面積幾乎無差異，表明濾膜對產品沒有吸附。

表1 濾膜吸附試驗

2.3 線性與范圍

以濃度（C）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，進行回歸分析，線性圖如圖3所示；線性方程為y=30976.7.2x-12809.9，r2=0.999 8。結果表明本品在8～96.0 μg/mL的濃度范圍內線性關系良好。

圖3 替米沙坦線性圖

2.4 重復性試驗結果

重復性試驗結果如表2所示，結果表明6份供試液含量相對標準偏差為0.21%，表明該方法重復性較好。

表2 重復性試驗（批號16037021，n=6）

2.5 中間精密度試驗結果

重復性試驗如表3所示，結果表明兩人測得含量RSD為0.75%，小于2%，表明該方法精密度良好。

表3 重復性試驗（批號16037021，n=6）

2.6 準確度（加樣回收率）

回收率試驗結果如表4所示，結果表明該方法含量測定準確度良好。

2.7 溶液穩定性結果

對照品溶液在24 h內RSD=0.19%，供試品溶液在24 h內RSD=0.12%，表明對照品和供試品溶液均具有良好的穩定性。

2.8 耐用性結果

耐用性結果見表5，結果表明在柱溫±5 ℃、波長±5 nm、流速±0.1 mL/min、流動相比例±3%、流動相pH±0.2及不同型號色譜柱等條件下，替米沙坦主峰的拖尾因子和理論塔板數沒有明顯的變化，含量的RSD值小于1.0%，說明該方法的耐用性良好。

表4 回收率試驗結果

表5 不同色譜條件下替米沙坦含量測定

2.9 含量測定

批號為16037011、16037021和16037181的3批供試品檢測結果分別為101.1%、100.8%、99.3%，差異不大。

3 結論

參照日本藥典JP16第二增補本，采用高效液相法進行替米沙坦含量測定，并進行了方法學考察，包括波長選擇、專屬性、線性、精密度、穩定性、重復性、回收率和耐用性試驗等。結果表明，該方法能準確測定本品含量，且專屬性高。