鈣離子ATP酶2a基因修飾的骨髓干細胞移植治療大鼠慢性心力衰竭

王曉露

（山西醫科大學晉祠學院，山西太原030025）

心力衰竭是各類型心臟疾病進展至終末期的常見疾病類型，據不完全統計，每年因心力衰竭死亡患者有40萬，其死亡率占同期心血管疾病的40%[1]。該病具有較高的致殘率、致死率，明顯增加了社會經濟負擔及衛生資源，成為全球關注的重點問題。近年來，藥物對心力衰竭的治療取得一定進展，但其療效欠佳，預后較差[2]。而心臟移植手術供體缺乏、排斥反應明顯，心肌成形術難以耐受，故需探索一種新的治療方法?；虔煼ā⒓毎浦彩墙陙磲t學領域新的治療策略，但基因療法需明確致病靶基因，降低基因表達擴散以及細胞移植的保護，提高其存活率等問題仍需進一步處理[3]。因此有研究[4]將基因療法與細胞移植相結合，以此修正兩種療法的缺陷，充分發揮治療作用。本研究擬建立慢性心力衰竭大鼠模型，分析鈣離子ATP酶2a基因修飾的骨髓干細胞移植治療作用，旨在為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選取由北京醫科大學動物實驗中心提供的雄性SD大鼠及雌性SD大鼠，4周齡，清潔級。將雄性大鼠作為骨髓供體，36只雌性大鼠為細胞移植受體及基因治療的受體，體重200～250g；正常飲食、飲水。

1.2 試劑與儀器

浙江醫科大學醫療儀器廠生產的小動物呼吸機，德國Leica公司生產的冰凍切片機，Philips公司生產的心臟超聲心動圖。胎牛血清、IMDM培養基、胰蛋白酶由Sigma公司提供，氯胺酮由上海第一生化藥業公司提供，蛋白酶K由北京精益化工產品公司提供。

1.3 實驗方法

模型建立：將36只雌性大鼠進行慢性心力衰竭大鼠模型建立，左冠狀動脈結扎，制作模型，造模成功后將其分為4組：對照組（n=9），腺病毒空載體；A組（n=9），鈣離子ATP酶2a基因治療；B組（n=9），骨髓干細胞移植治療；C組（n=9），經基因修飾后的骨髓干細胞移植治療。另選取雄性大鼠作為骨髓供體。

骨髓干細胞：雄性大鼠乙醚麻醉后，處死。取下肢長骨，骨腔沖洗，離心10 min，轉速15 000 r/min，留取中間層液體，添加磷酸鹽緩沖液，離心3次，轉速1 500 r/min，丟棄淋巴細胞分離液。將細胞添加培養瓶（含有20%胎牛血清、青霉素100 mg/L、鏈霉素100 mg/L）內，37 ℃，置入培養箱內培養。每3 d更換一次液，顯微鏡下觀察細胞生長。當其將近鋪滿瓶底，進行傳代至第3代，取出非貼壁的球形骨髓造血細胞，獲取純化骨髓干細胞。

骨髓干細胞生長至90%并匯合，培養液吸取，置入鈣離子ATP酶2a病毒工作液、無血清的IMDM培養基，將其孵化12 h，病毒液吸取后繼續培養。轉染第2 d，顯微鏡下觀察細胞有綠色熒光表達，收取細胞，以0.25%胰蛋白酶消化，待細胞變圓以完全培養基停止消化，離心10 min，轉速1 000 r/min，丟棄上清液，觀察計數。B、C組移植5×106個細胞。

1.4 觀察指標

（1）大鼠模型建立后，于治療前、治療后采用超聲心動圖評價其心臟功能，包括左室前壁、室間隔收縮與舒張期縱向峰值速度、左室射血分數（LVEF）；（2）統計骨髓干細胞陽性率，即利用染料Hoechest標記，選取10個視野內陽性細胞比例；（3）統計肌漿網鈣離子ATP酶2a基因及蛋白表達，提取心肌組織內的DNA、RNA，以PCR鑒定；取心肌組織2g，以組織裂解液裂解，反復凍融，離心，采集上清蛋白質樣本，并測定其含量。

1.5 統計學方法

SPSS20.0統計學軟件處理數據。計量資料用（±s）表示，采取重復方差F檢驗；計數資料用百分比率（%）表示，采取χ2檢驗；P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 慢性心力衰竭模型建立

大鼠行左冠狀動脈結扎4周后，超聲心動圖測定左室射血分數≤45%，左室短軸切面呈不規則扭動或不規則擺動，各切面左室前壁、側壁菲薄，向外膨出，室壁節段性運動異常，對側室壁運動加強。長軸切面顯示左室輪廓擴大呈球形，即為慢性心力衰竭建立成功。

2.2 骨髓干細胞移植存活率

治療21 d，經連續切片綠色熒光染色檢測，C組骨髓干細胞移植存活率98%，B組骨髓干細胞移植存活率72%，差異有統計學意義（P≤0.05）。

2.3 心臟功能

如表1所示，治療后21 d，A、B、C組的LVEF明顯高于對照組，左室前壁、室間隔收縮與舒張期縱向峰值速度高于對照組，其中C組較A、B組升高明顯，差異有統計學意義（P≤0.05）。

表1 比較四組LVEF及左室前壁、室間隔收縮與舒張期縱向峰值速度

2.4 肌漿網鈣離子ATP酶2a基因及蛋白表達

如表2所示，治療后21 d，A、C組肌漿網鈣離子ATP酶2a基因及蛋白表達明顯高于B組、對照組，其中C組表達提高明顯，差異有統計學意義（P≤ 0.05）。

表2 肌漿網鈣離子ATP酶2a蛋白表達（U/mg）

3 討論

近年來，我國心力衰竭發生率及帶來的經濟負擔呈逐年增加趨勢，成為世界衛生組織重點關注的疾病。隨著現代醫療技術的發展，對心力衰竭致病機制的研究日漸深入，并提出基因療法、細胞移植療法，以期保護心肌組織，挽救瀕臨死亡的心肌組織，增強心肌功能[5]?，F今，基因療法集中在細胞及動物實驗，其面臨的主要問題是如何發現并解決致病靶基因，提高基因轉染率，確定轉向導基因載體，進行基因表達調控[6]。細胞移植是當前治療心臟疾病的新型研究策略，多種細胞類型已用于臨床研究，其中以骨髓干細胞具有獨特的增殖、多向分化作用，可轉為心肌細胞、內皮細胞及血管平滑肌細胞，但細胞-細胞、細胞-細胞外基質間的作用，會影響細胞分化，且細胞存活率也受到臨床重點關注。故此，在基因修飾下進行細胞移植，在體外對細胞進行基因轉染，可有效調控基因表達，降低基因表達的失控率，提高基因療法的安全性；同時移植細胞經基因修飾，可提高移植細胞的存活率及存活功能。兩者相互補充、相互作用，將骨髓干細胞作為載體，結合基因修飾作用，能夠發揮潛在的治療優勢[7]。

在心力衰竭病理狀態下，肌漿網鈣離子ATP酶2a基因mRNA豐度、蛋白表面明顯降低，使Ca2+的穩態及活動異常，致心肌收縮力降低。肌漿網鈣離子ATP酶主要分布在心肌肌漿網，可調整心肌細胞內鈣離子的穩定及活動，與心肌收縮、舒張功能密切相關，且參與了心肌細胞電節律、凋亡等生理活動[8]。肌漿網鈣離子ATP酶2a基因作為治療心力衰竭的新型靶基因，在機體生理狀態下，會消耗ATP逆濃度，將胞漿內Ca2+轉移至肌漿網，同時在磷酸化時，可使受磷蛋白（PLM）肌漿網鈣離子ATP酶2a基因復合物結締，增強對Ca2+的親和性[9]。但其表達率、轉染率的控制，仍影響著臨床治療。骨髓干細胞治療策略可提高心力衰竭的心臟功能，縮小梗死面積，增加室壁厚度，但細胞存活率較低。故采用鈣離子ATP酶2a基因修飾的骨髓干細胞移植治療策略，利用鈣離子ATP酶2a基因轉染骨髓干細胞后，成功組裝并表達鈣離子ATP酶2a基因蛋白，以此發揮基因療法及細胞移植的作用[10]。本組研究中，治療21d，C組骨髓干細胞移植存活率為98%，高于B組的72%，B、C組的LVEF高于對照組，左室前壁、室間隔收縮與舒張期縱向峰值速度高于對照組，其中C組較A、B組升高明顯（P≤0.05）。A、C組肌漿網鈣離子ATP酶2a基因及蛋白表達明顯高于B組、對照組，其中C組表達提高明顯（P≤0.05）。研究提示，較單純基因療法、細胞移植策略相比，鈣離子ATP酶2a基因轉染骨髓干細胞治療慢性心力衰竭，可顯著恢復大鼠的心功能，具有更為穩定、持久的作用效應，且骨髓干細胞移植能夠有效調控基因表達；而基因修飾能夠提高移植細胞存活率及治療效應。

4 結論

鈣離子ATP酶2a基因修飾的骨髓干細胞移植治療大鼠慢性心力衰竭具有一定效果，心臟功能改善明顯，將骨髓干細胞作為治療基礎的細胞載體，以基因修飾細胞，兩者相互作用，可提高其治療作用。