聚乳酸/海藻多糖電紡支架的制備工藝研究

張茜

（上海藥明康德新藥開發有限公司，上海 200131）

組織工程學經過33年的發展，已經成為一門研究開發生物活性替代物的專業學科。血管組織工程技術是利用血管細胞與可降解材料來構建血管替代物的一門技術，血管支架是血管組織工程的重中之重，靜電紡絲法以其獨特的技術為血管的修復和移植提供了一種新的選擇。以玉米為主要原料的聚乳酸，具有良好的生物性能，且無毒性、可降解，可以廣泛用于藥理學研究及臨床研究等方面。海藻多糖是一種水溶性多糖，易于人體吸收，生物活性強，且原料豐富易于提取。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

海藻多糖，西安西海生物科技有限公司；聚乳酸，上海塑享貿易有限公司；明膠，上海山浦化工有限公司；草酸銨和EDTA-Na2為分析純，蘭州科器化玻有限公司；氯仿和無水乙醇為分析純，天津市富寧精細化工有限公司；蒸餾水，蘭州鋒源純凈水有限公司；小鼠血清，蘭州大學動物實驗中心。

TJ-1000高壓靜電發生，天津大學現代科技有限公司；移液槍（10～1 000 μL），蘭州博輝化玻儀器有限公司；IX71-A21PH光學顯微鏡，奧林巴斯；ES-2002H電子天平，長沙湘平科技發展有限公司；游標卡尺，蘭州科器化玻有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 聚乳酸溶液的配制

取干燥潔凈的燒杯，準確稱取 0.6 g、0.8 g、1.0 g和1.2 g聚乳酸后，加入10 mL氯仿，密封、靜置，溶解后攪拌至澄清，制得6%，8%，10%，12%不同濃度的聚乳酸溶液。

1.2.2 多糖明膠溶液的配制

多糖明膠溶液：準確稱取 0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g和1.0 g多糖至潔凈干燥的燒杯中，加入10 mL蒸餾水，配置成濃度為2%、4%、6%、8%和10%的多糖溶液，加熱溶解，后準確稱取7.0 g明膠，加入已溶解的多糖溶液中，加熱振蕩使溶解完全。

1.2.3 復合電紡支架的構建

靜電紡裝置見圖1。由于多糖溶液和聚乳酸溶液互不相容，因此采用夾層靜電紡絲方法，并以旋轉的軸心來收集帶電的聚合物射流形成的細絲，先在旋轉軸上收集10%的聚乳酸形成纖維層，隨后覆蓋一層多糖纖維，然后繼續收集聚乳酸纖維層，重復幾次。

收集聚乳酸時采用自動裝置，用1 mL的玻璃針管吸取不同濃度聚乳酸1 mL，用鐵架臺固定，使針管和地面豎直，調整接收距離為12 cm，高壓靜電發生器的電源電壓設置為12 kV，收集裝置接地，注射泵流速設為0.8 mL/h，開通電源。收集多糖時采用手推裝置，用1 mL塑料針管吸取不同濃度多糖溶液，用鐵架臺固定，使針管和地面平行，接收距為10 cm，針頭接15 kV的電壓，收集裝置接地，開通電源。改變接收距、電源電壓和注射泵流速，構建不同參數下的復合電紡支架。

圖1 聚乳酸靜電紡裝置（a）和多糖靜電紡裝置（b）

1.2.4 力學性能測定

（1）抗拉強度：從不同濃度的復合電紡支架上切取3段3.00 cm的支架，每段任意選擇5點測其厚度，計算其平均值，即為厚度，計算橫截面積；任取一段支架，一端固定，另一端用夾子固定在空的礦泉水瓶中，使整個裝置垂直于地面，然后慢慢向礦泉水瓶中加水，直到細長條斷裂，稱量礦泉水的重量，計算出最大荷重，按照公式1計算抗拉強度。

（2）斷裂伸長率：從不同濃度的復合支架上切取2.00 cm的支架，固定在游標卡尺上，適量拉伸，直到即將斷裂，用游標卡尺計算出拉伸后的長度，按照公式2計算斷裂伸長率。

（3）爆破強度：取最優工藝的電紡管狀支架1 cm，鋪成矩形，取緊鄰6個點測最大爆破強度，然后用其堵住真空泵，打開真空泵，在壓力表上讀出數據，即為爆破強度。

1.2.5 血小板黏附性實驗

（1）血液的稀釋抗凝

無抗凝劑的新鮮血液，一段時間后會自動結塊，無法用來測量血小板的黏附性實驗。為了讓血液保持完好且不影響血小板的形狀，必須在新鮮的血液里添加抗凝劑。實驗中選用草酸銨稀釋液阻止血液凝固，稀釋之后血小板形態清晰，便于觀察。

草酸銨稀釋液的配制方法為：準確秤取5.0 g草酸銨、0.06 g EDTA-Na2，加適量蒸餾水使其完全溶解；為除去溶液里面的雜質，用多層濾紙過濾2次，以防雜質干擾血小板的觀察；然后把濾液定容至500 mL即可；密封好，保存在4 ℃的冰箱里備用。

取1.0 mL新鮮血液，加入配好的草酸銨稀釋至10 mL，裝入離心管中，總共取5管，存4 ℃冰箱備用。

（2）血小板黏附性實驗

把原來稀釋10倍的血液用移液槍取出5 mL置于10 mL離心管中，加2.5 mL草酸銨稀釋液制得血液的15倍稀釋液；然后用移液槍取200 μL置于計數板中，靜置5 min后在光學顯微鏡的高倍鏡下，觀察血小板數并記錄，得出黏附前血小板數目。

準備含有0%、2%、4%、6%、8%和10%多糖的聚乳酸復合電紡，用剪刀小心地剪取6段長度均為0.8 mm的電紡支架，并沿著管孔把血管支架剪開，形成一矩形即可。準備1個大培養皿和6個潔凈干燥的小培養皿，分別編號1～6。把事先準備好的6段電放支架依次放入6個小培養皿，分別添加1 mL草酸銨稀釋液，蓋上蓋子后放入大培養皿中，然后在恒溫38 ℃水浴鍋中孵育20 min。20 min后盡量倒干6個小培養皿中的稀釋液，再向小培養皿各加500 μL的血液15倍稀釋液。蓋上蓋子，在38 ℃水浴鍋中保溫40 min后取出，用鑷子夾著電紡膜，小心緩慢地用500 μL草酸銨稀釋液清洗掉電紡膜上的血液，清洗液合并到原來的小培養皿中，即血液由15倍變為30倍。然后用移液槍取200 μL小培養皿中的血液置計數板中，靜置5 min后在光學顯微鏡的高倍鏡下，觀察血小板數，并記錄數據，得出黏附后的血小板數目。按照公式3計算血小板的黏附率。

2 結果與分析

2.1 電紡工藝

2.1.1 聚乳酸和多糖的濃度

（1）聚乳酸濃度

實驗發現，當聚乳酸含量過低時，溶液太稀，即使高壓條件也無法形成纖維；含量過高時，溶液太黏，噴射液會堵塞針頭，并且纖維過粗過硬。見表1，因此，最終將聚乳酸濃度設為10%。

（2）多糖濃度

在實驗過程中，以不同濃度梯度（2%、4%、6%、8%和10%）的多糖溶液進行紡絲，發現不同濃度的多糖都能形成電紡纖維。因此，多糖濃度并不是影響電紡纖維的主要因素。

2.1.2 接收距

接收距能夠影響納米纖維形態的參數。實驗中，在電場不被干擾的情況下，當接收距取值較小時，出絲效果不明顯，呈液滴狀態，很難形成纖維；當接收距過大，電紡產生的纖維難以集中于滾軸收集器上，在收集器的周圍及電場外都有分布。通過實驗，最終確定最優的聚乳酸接收距為12 cm，多糖接受距為13 cm。

2.1.3 電壓

在其他因素一定的條件下，實驗設定了電壓分別為10 kV、15 kV和20 kV的電場。當電壓為10 kV時，噴射流開始釋放，卻并不流暢，導致滾軸收集器形成的電紡纖維不夠連續；電壓升高至15 kV，滾軸收集器形成的電紡管狀支架很理想；當電壓繼續升高至20 kV，電場強度的增大使得多次紡絲形成的纖維出現更多的缺陷。因此，電壓取15 kV為宜。

2.1.4 紡絲液流速

相關研究表明，紡絲液流速是影響纖維形態的次級因素之一[17]。紡絲液流速和電壓是兩個互相作用的參數，其一值的變化會引起另一值的改變。考慮到電壓的設定，流速也將隨之調整。綜合考慮所有參數，將聚乳酸紡絲液流速設定為3個值：0.2 mL/h、0.8 mL/h和1.0 mL/h。當流速太慢時，電紡過程中會產生小液珠滴落的現象，影響成絲效果；流速過快時，電紡產生的纖維會出現過多孔眼。因此，將聚乳酸紡絲液流速的優化值設定為0.8 mL/h。另外多糖明膠溶液紡絲時流速控制是關鍵，流速過快時，因轉速一定，出絲量大，使得滾軸收集到的纖維絲纏繞得松散不緊密，最終導致紡出的管子強度不夠；流速過慢時，針頭易被堵塞，很難出絲。因此，多糖明膠紡絲液的流速優化值設定為4.8 mL/h，此條件下形成的電紡纖維形狀較為完好。

表1 不同濃度聚乳酸纖維現象

2.2 力學性能

2.2.1 抗拉強度

由于靜電紡絲的原理和方法相同，測得平均厚度均為0.042 cm，則原橫截面積為s=0.5×0.042=0.021 cm2（g=9.8 N/kg，1 N/cm2=1 Pa=10-3kPa）。不同多糖濃度的電紡支架抗拉強度結果見表2。當厚度一定，即橫截面積不變時，隨著多糖濃度的增加，抗拉強度呈上升趨勢。

表2 不同多糖濃度的電紡支架的抗拉強度

2.2.2 斷裂伸長率

在實驗過程中，所截取的細長條長度均為2.00 cm，即拉伸前長度為2.00 cm。不同多糖濃度的電紡支架的斷裂強度見表3。當厚度一定，即橫截面積不變時，隨著多糖濃度的增加，斷裂伸長率基本在30%附近波動。

表3 不同多糖濃度的電紡支架的斷裂強度

2.2.3 爆破強度

取聚乳酸濃度為10%、接收距離為12 cm、電壓為12 kV、紡絲液流速為0.8 mL/h；海藻多糖明膠溶液靜電紡絲接受距離為10 cm、電壓為15 kV、流速為4.8 mL/h時的電紡管狀支架1.0 cm，鋪成矩形，取緊鄰6個點測最大爆破強度，真空泵壓力表上的讀數分別為0.050 MPa、0.046 MPa、0.052 MPa、0.050 MPa、0.048 MPa和 0.046 MPa，取平均值為0.048 MPa。這一數值遠遠超過了人體血管所能承受的壓力。

2.2.4 血小板粘附實驗

15倍血液黏附前的血小板總數取3次平行測定結果的平均值，結果為127.66。不同多糖濃度的電紡支架血小板黏附率如表4所示。隨多糖濃度升高，電紡支架的粘附率逐漸減小，而表中6%多糖濃度的血管支架的粘附率出現偏差，可能是紡絲過程中出現誤差，或者是測血小板粘附性時，育孵、顯微鏡計數板讀數時產生讀數誤差，使得該濃度下的粘附率出現偏高。但8%、10%濃度支架的粘附率均低于2%、4%的支架的粘附率，總體上血管支架的粘附率隨多糖濃度的升高而降低，10%聚乳酸的電紡支架在相同條件下未添加多糖時對血小板的黏附率最高。

表4 不同多糖濃度的電紡支架血小板粘附率

3 討論

實驗中構建電紡支架時，如果聚乳酸的溶解時間過長，造成氯仿揮發過多，會使得聚乳酸的濃度過大，流速減慢，容易使針頭堵塞，紡出的電紡管狀支架過硬過脆，無法達到預期要求；紡聚乳酸時，利用重力場作用，若轉軸的接收距離控制不好，會造成紡出的絲很難接收，通過改進，在重力場和電場力的同時作用下，聚乳酸溶液可以順利出絲，成絲效果很理想；紡多糖時采用手推法，流速控制不好會使得噴出的絲粗細不均勻，且時間掌握不好針頭容易堵塞，通過對裝置改進并熟練操作過程，可以使得紡出的電紡支架韌性、柔軟性都很好。

正常情況下，人體股動脈理論抗拉強度為0.7～1.0 MPa，理論斷裂伸長率36%～46%。現階段使用的人造血管，是由膨體聚四氟乙烯材料制成，其抗拉強度為0.6～1.5 MPa，斷裂伸長率為20%～30%。實驗制備的復合電紡支架在多糖濃度為10%時，更接近人體股動脈的抗拉強度。多糖濃度為4%、6%、8%時，復合電紡管狀支架的斷裂伸長率接近正常人體股動脈的斷裂伸長率。因此，當聚乳酸濃度為10%，多糖濃度為10%時，復合電紡人造血管的抗拉強度和斷裂伸長率均高于或接近人體血管，抗拉強度和斷裂生長率符合移植的基本要求。另外，復合電紡的爆破強度也是主要影響因素，人體在正常靜息狀態下的血壓值收縮壓不超過140 mmHg，舒張壓不超過90 mmHg，隱靜脈承受的最大壓力為（1 680±307）mmHg，約合（223.0±40.8）kPa。實驗過程中所得到的爆破強度值為483 kPa，符合要求。因此復合管裝支架的力學性能接近人造血管。

本實驗中，通過加入海藻多糖明顯改善了純PLA的血液相容性，能夠更好地抑制血小板的黏附，即在純PLA中加入海藻多糖后，復合電紡材料的抗黏附率更好。另外，海藻多糖的加入改變了復合電紡材料的表面電荷和和化學結構，同時由于硫酸根基團與硫酸纖維素鈉的抗凝血活性的影響，使得加了海藻多糖后的復合材料具有良好的血液相容性。

4 結論

采用復合管狀支架的靜電紡絲法，以高速旋轉的軸心收集帶電的聚合物射流形成的細絲，成功構建了PLA/海藻多糖復合電紡管狀支架。隨著多糖的加入，復合電紡管狀支架的韌性增加，斷裂伸長率基本維持在一定的范圍內，血小板粘附性整體呈下降趨勢。說明材料的血液相容性得到了明顯的改善。濃度為10%聚乳酸、10%多糖的復合電紡管狀支架的爆破強度超過人體血管所承受的最大壓力，且血小板粘附率最低，可作為血管移植工程的人造血管。