透明質酸/殼聚糖雙層修飾的介孔生物活性玻璃的制備與性能研究

仇可新

（上海雙申醫療器械股份有限公司，上海 201707）

在骨修復領域，骨組織工程支架近年來向著生物活性支架方向發展，這樣不僅在結構上能夠支撐細胞的粘附，還能夠在組成上提供生物活性因子來促進骨的再生[1-2]。具體地，一方面是支架結構的限制，即支架中心的營養供應和細胞活力經常受到嚴重阻礙，這主要是因為細胞生存所需的營養和氧氣的擴散距離在150～200 μm[3]，因此可以通過改變支架結構來解決這個問題，制備大孔結構的生物支架，對細胞的生長具有促進作用[4]。另一方面，研究表明在支架表面能夠形成小于5 mm的組織層，這會導致支架中心的細胞密度降低，而且容易產生細胞壞死[5]。因此，為了解決這個問題，在支架上負載骨形態發生蛋白等生物活性因子，能夠刺激細胞的分化和組織的生長[6-7]。

近年來，介孔生物活性玻璃（MBG）在骨組織工程領域已經引起了廣泛的關注[8-9]。與無介孔結構的生物活性玻璃（BG）相比，MBG具有不同的介孔結構和生物活性，在結構上具有更高的比表面積和更大的容積，不僅能夠傳輸蛋白或藥物分子，增強體外的生物活性，而且可以縮短降解時間[10]，在骨組織工程和藥物傳輸方面具有巨大的應用前景。

然而，MBG負載生物活性因子容易發生泄漏和浪費問題，將MBG的孔道進行包裹以使生物活性因子緩釋發生作用，對MBG支架的生物活性和生物活性因子的利用率具有促進作用[11]。因此，采用透明質酸（HA）和殼聚糖（CS）雙層修飾MBG，制備復合支架MBG-HA/CS，選擇地塞米松（DEX）進行負載，研究其緩釋效果和生物相容性。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

P123（EO20-PO70-EO20，Mn -5800）、聚 氨酯海綿、殼聚糖（CS，Mw 50000-190000 Da）、透明質酸（HA，Mw 500000 Da）、正硅酸乙酯（TEOS，98%）、3-氨基丙基-三乙氧基硅烷（APTES，98%）、磷酸三乙酯（TEP，99.8%）和地塞米松（DEX）購于美國Sigma-Aldrich公司。鹽酸（HCl，分析純）、硝酸鈣（Ca(NO3)2·4H2O, ≥99.0%）、1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC, Mw 191.70）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS, Mw 115.09）和其它化學試劑采購于國藥集團。FITC標記的鬼筆環肽溶液購買于碧云天生物技術有限公司。

掃描電子顯微鏡（SEM，日本Hitachi），透射電子顯微鏡（TEM，日本Hitachi），X射線多晶衍射儀（XRD，日本Rigaku），熱重分析儀（TG，Germany），激光共聚焦顯微鏡(CLSM，德國Carl Zeiss LSM 700)。

1.2 MBG的制備和修飾

以聚合物P123（EO20-PO70-EO20）和聚氨酯海綿作為共模板劑制備具有介孔結構的MBG多孔支架[12]。P123用于制造支架的介孔結構（介孔尺寸為幾個納米），而聚氨酯海綿制造支架的的大孔結構（大孔徑為幾百微米）。將12 g P123、20.1 g TEOS、4.2 g Ca(NO3)2·4H2O、2.19 g TEP和3 g HCl（0.5 mol/L）溶于180 g乙醇中，室溫攪拌24 h。然后，用蒸餾水將聚氨酯海綿清洗干凈，烘干后備用。將聚氨酯海綿放入上述混合溶液中完全浸泡10 min，然后轉移到培養皿中，在室溫下晾干，此過程重復3次。待樣品完全干燥后，置于650 ℃的馬弗爐中煅燒5 h，最后得到具有介孔結構的MBG多孔支架材料。

隨后，MBG多孔支架進行氨基化處理[13]。將1 g MBG放入含有1 mL APTES的無水乙醇中浸泡24 h。取出后用無水乙醇沖洗3次，除去多余的APTES，得到氨基修飾的MBG支架（記為MBG-NH2）。

MBG-NH2支架進行HA和CS修飾。稱取0.2 g EDC和0.37 g NHS溶于20 mL去離子水中，稱取113 mg HA溶于60 mL去離子水中；然后將兩種溶液混合，使用三乙胺溶液調節溶液pH至9.0。將1 g MBG-NH2放入上述混合溶液中，保持38 ℃條件下攪拌過夜，最后用去離子水清洗樣品[14]。使用質量分數為1%的乙酸溶液配制2 mg/mL的殼聚糖溶液，將MBG-HA支架置于上述溶液中，浸泡1 h，然后用去離子水沖洗并真空干燥，最后得到透明質酸和殼聚糖修飾的MBG支架（記為MBG-HA/CS）[15]。

1.3 支架的表征和性能測試

通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察MBG支架的表面形貌和內部結構；使用X射線多晶衍射儀對MBG支架的物相進行分析；通過熱重分析儀對MBG-HA/CS的物料變化進一步分析。

1.4 DEX的負載和釋放

DEX為合成糖皮質激素，被廣泛用于骨組織工程中，研究表明DEX能夠誘導骨細胞的分化和骨組織形成[16-17]，因此選用DEX用于藥物釋放的研究。0.1 g MBG-HA/CS支架材料放入5 mL乙醇溶液中，加入5 mg DEX[18]。在室溫下，避光攪拌12 h，再放入真空干燥箱內促使乙醇溶液的蒸發和藥物的吸附。隨后，將載藥的支架材料（DEX@MBG-HA/CS）放入磷酸緩沖液（PBS）中清洗數次，除去樣品表面的藥物。收集所有的清洗液，通過紫外-可見分光光度計在242 nm下進行吸光度的測量，借助DEX的標準曲線計算DEX@MBG-HA/CS支架中DEX的裝載量。經計算，DEX@MBG-HA/CS中DEX的裝載量為2.28 mg/g。

將DEX@MBG-HA/CS浸泡在5 mL PBS（pH 7.4）中，保持在37 ℃條件下。在每個設定的時間點，取出緩釋溶液并進行收集，然后加入同體積的新鮮PBS溶液。通過紫外-可見分光光度計測量收集的緩釋液的吸光度，分析計算DEX的釋放量，最終得到每個時間點DEX累計釋放量并繪制釋放曲線。每個時間點設置3個平行樣。

1.5 細胞相容性研究

所有的支架樣品經環氧乙烷滅菌處理。分別將無菌的MBG和DEX@MBG-HA/CS支架置于24孔培養板內，并用無菌鋼環壓住，然后以5×104細胞/孔的密度接種小鼠MC3T3-E成骨細胞。將其置于恒溫細胞培養箱中培養1 d、3 d和5 d，期間每2 d更換一次新鮮培養基。待到預定的時間點，將培養基移除，用4%多聚甲醛固定細胞30 min。用PBS沖洗2遍每個樣品孔，先用0.1%曲拉通X-100溶液進行通透5 min，再用1% BSA溶液處理20 min。用PBS洗凈后，加入FITC標記的鬼筆環肽溶液（165 nmol/L）對細胞進行染色30 min。最后，樣品經PBS洗后用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）進行觀察并拍攝照片。

2 結果

2.1 掃描電鏡和透射電鏡觀察

由SEM照片（圖1A、B和C）可以看出，MBG支架呈現明顯的多孔結構，孔與孔之間具有高度連通性，孔的直徑為100～300 μm。由TEM照片（圖1D）可以清晰看到MBG支架介孔孔道結構，孔道直徑約為3 nm，并且均一有序。因此，MBG支架的大孔和多孔結構有利于細胞所需的營養物質輸送，而其介孔結構可以用于藥物等生物活性小分子的運輸[19]。

2.2 X射線衍射分析

XRD圖譜（圖2）顯示MBG支架沒有明顯的晶體特征峰，在2θ=23°中心處有一個寬峰，表明制備的MBG支架是無定型的[12，20]。

圖1 MBG支架的SEM照片和TEM照片

圖2 MBG支架的XRD圖譜

2.3 MBG、MBG-HA和MBG-HA/CS的熱力學性能分析

通過熱重分析法分析MBG、MBG-HA和MBGHA/CS的熱力學性能。由圖3可以看出，在100 ℃之前，MBG、MBG-HA和MBG-HA/CS的熱量均有所降低，這主要是水分蒸發引起的。隨后主要是殘留的模板劑、包裹的HA和CS的分解，導致樣品質量的下降。最后MBG、MBG-HA和MBG-HA/CS支架的殘留量分別為90.73%、88.14%和87.08%。該結果表明MBG上HA和CS的成功包裹。

2.4 藥物釋放曲線

由圖4的DEX釋放曲線可以看出，釋放主要表現為兩個階段：DEX在開始7 d以較快的速率進行釋放，在隨后的21 d表現為穩定長期的釋放過程。這可能是由于DEX負載于MBG-HA/CS的孔道和HA/CS的包裹層內，當樣品置于PBS緩釋液中，HA/CS包裹層內的DEX快速釋放到溶液中；隨后，MBG-HA/CS孔道內的藥物逐漸釋放出來。在28 d時，DEX@MBG-HA/CS支架的DEX累計釋放量為75%，表明DEX從DEX@MBG-HA/CS支架中釋放呈現較好的緩釋效果。

圖3 MBG、MBG-HA和MBG-HA/CS的TGA曲線

圖4 DEX釋放曲線

2.5 細胞相容性研究

將成骨細胞MC3T3-E1接種到MBG和DEX@MBG-HA/CS支架上，培養1 d、3 d和5 d后，對細胞質進行染色后通過激光共聚焦顯微鏡（CLSM）進行觀察。由圖5可以看出細胞能夠在MBG和DEX@MBG-HA/CS支架上粘附和生長，隨著時間的延長，細胞的尺寸開始慢慢變大，由圓點形狀逐漸變成海星形狀。尤其在DEX@MBG-HA/CS支架上，相比與MBG支架上，成骨細胞伸展良好，出現更多絲狀偽足，粘附在支架上，這說明釋放的DEX能夠促進細胞的粘附和生長。

3 結論

本文制得的MBG支架具有孔徑為100～300 μm相互連通的大孔結構和孔道大約為3 nm的介孔結構，并通過透明質酸和殼聚糖雙層修飾后負載地塞米松（DEX），成功制得復合載藥支架（DEX@MBGHA/CS）。DEX的釋放行為表現為開始7 d快速釋放，隨后21 d長期緩慢釋放，起到一定的緩釋作用。成骨細胞在DEX@MBG-HA/CS培養后，細胞粘附和生長良好。生物活性玻璃經修飾后表現出的優異載藥性能，應用到骨修復中具有良好的前景。

圖5 細胞激光共聚焦顯微照片（200倍）