伊豆錦葡萄皮花青素的樹脂純化及穩(wěn)定性研究

生慶海，閆 斌，王 曄，2，劉 坤，賈艷菊

（1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050061；2.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029）

花青素是一類常見的天然色素，主要存在于植物的果實、葉片和花中，使植物呈現(xiàn)不同顏色[1]。由于花青素不穩(wěn)定，天然條件下花青素通常與糖形成花色苷。花色苷是黃酮類物質(zhì)，是可以安全食用的植物色素[2]。可以作為食品添加劑、著色劑應(yīng)用于食品，相對于合成色素，天然色素滿足了人們對于食品安全的要求，近年來越來越受到人們的歡迎。

天然花色素的純化一般以植物為原料，常見的有楊梅、越橘、火龍果、葡萄、紅心蘿卜等[3]，但由于其含量較低且價格較高等原因，在我國只有較少的開發(fā)利用，不能滿足市場的需求[4]。大孔樹脂吸附法是目前純化花色苷類物質(zhì)最常用的方法，效果較好的大孔樹脂有XAD-7HP，X-5，AB-8，NKA-9型等[5]。伊豆錦葡萄是景川彥雄于1970年雜交得到的葡萄品種，屬于巨峰群品種，粒大飽滿，呈紫黑色，微有草莓香味，皮厚肉脆[6]。伊豆錦葡萄皮含有大量的花青素，目前還沒有關(guān)于其花青素提取及穩(wěn)定性的研究。試驗以伊豆錦葡萄皮為原料，研究其葡萄皮中花青素的純化及穩(wěn)定性，為伊豆錦葡萄資源的開發(fā)利用和天然花青素的獲取、應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料：伊豆錦葡萄，2016年9月購自紫藤葡萄莊園。剔除果肉的果皮，風(fēng)干打成粉，過40目篩，干燥器中保藏，備用。

主要試劑：檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸乙酯、沒食子酸、福林酚等，均為國產(chǎn)分析純；ADS-8，AB-8，HPD-100A，SP207型大孔樹脂，天津尖峰天然產(chǎn)物研究公司提供。

主要儀器：R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；UV-5200B型紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C型數(shù)字顯示酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 伊豆錦葡萄皮色素色價的測定

參照鄧潔紅等人[7]的方法，稍作改變。配制酸性乙醇溶液（乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，pH值2.31），取4支離心管，每支離心管中加入0.5 g葡萄皮粉和20 mL提取液，浸提3 h后離心20 min，取上清液。一直提取至上清液無色，將所有上清液匯總過濾，最后一次的上清液和渣粉一起過濾定容，用濃度為0.1 mol/L的檸檬酸和濃度為0.1 mol/L的檸檬酸鈉按一定的比例配成pH值為3的緩沖溶液，用分光光度計于波長500～700 nm內(nèi)掃描，找到最大吸收峰。計算出色價。

式中：A——吸光度；

W——葡萄皮質(zhì)量，g。

結(jié)果表明，尹豆錦花青素溶液于波長543 nm處有最大吸收峰，故選擇543 nm作為測定波長，伊豆錦葡萄皮中色素的色價為6.7。

1.2.2 伊豆錦葡萄皮花青素的提取

稱取50 g葡萄皮渣，加入酸性乙醇溶液（pH值2.31，60%乙醇），比例為1∶30，超聲波輔助提取60 min，于40℃下抽濾，將粗提液在45℃下以轉(zhuǎn)速100 r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加入2倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，分層后取水相，萃取2次，于4℃下保存。

1.2.3 樹脂的選擇

準(zhǔn)確稱量已經(jīng)活化好的 ADS-8，AB-8，HPD-100A，SP207型4種大孔吸附樹脂各0.5 g，配制pH值2.47（含乙醇6.6%）的花青素溶液（C0），取15 mL，置于100 mL三角瓶中，于20℃下以轉(zhuǎn)速100 r/min培養(yǎng)20 h。測溶液中花青素濃度（C1），計算吸附率。吸附完成后，蒸餾水洗脫，再分別加入15 mL酸性乙醇溶液（pH值2.47，80%乙醇，0.3%檸檬酸），25℃下解析20 h，測定解析液中花青素的質(zhì)量濃度（C2），計算解析率。每組設(shè)置3組平行試驗。

式中：C0——吸附前溶液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；

C1——吸附后溶液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；

C2——解析后溶液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.4 伊豆錦葡萄皮花青素濃縮液的制備

選擇最佳樹脂進(jìn)行活化，裝柱，在上柱液pH值2.0，流速1 mL/min的條件下進(jìn)行純化，用酸性乙醇溶液（pH值2.47，80%乙醇，0.3%檸檬酸）進(jìn)行解析，得到濃縮溶液。

1.2.5 伊豆錦葡萄皮花青素穩(wěn)定性分析

（1） 光照對穩(wěn)定性的影響。取一定量濃縮溶液，稀釋到一定色價，分別取10 mL置于透明玻璃樣品瓶中，封口，分別置于黑暗、自然光、日光燈下的環(huán)境中，每2 d取樣測定樣品溶液中花青素含量，以保存率表示原花青素穩(wěn)定性，計算公式為：

式中：W1——檢測時樣品中花青素含量，%；

W2——初始樣品中原花青素含量，%。

（2）溫度對穩(wěn)定性的影響。取一定量濃縮溶液，稀釋到一定色價，分別取10 mL置于透明玻璃樣品瓶中，封口，分別位于4℃，室溫，40，60，80℃下進(jìn)行保存，每隔1 h測1次吸光度，其他步驟同1.2.5（1）。

（3）pH值對穩(wěn)定性的影響。取一定量的花青素濃縮液，稀釋成pH值為2.2，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的溶液，觀察顏色變化，測定吸光度。

（4）金屬離子對穩(wěn)定性的影響。取一定量濃縮溶液，稀釋到一定色價，分別取10 mL置于透明玻璃樣品瓶中，分別加入 K+，Na+，Ca2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Al3+，使溶液中各類離子的濃度分別達(dá)到1 mmol/L和10mmol/L，每1h測1次吸光度，其他步驟同1.2.5（1）。

（5）氧化劑對穩(wěn)定性的影響。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，1.00%，2.00%，3.00%的H2O2溶液，依次取5 mL的花青素溶液，分別用不同濃度的H2O2溶液定容，分別在0，1，2，3，4，5 h后測定其于波長543 nm處的吸光度，其他步驟同1.2.5（1）。

（6）還原劑對穩(wěn)定性的影響。配制質(zhì)量濃度分別為0.04，0.08，0.16，0.32 g/L的維C溶液，依次吸取5 mL伊豆錦葡萄皮色素液，分別用不同濃度的維C溶液定容，分別在0，1，2，3，4，5 h后測定其于波長543 nm處的吸光度，其他步驟同1.2.5（1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的選擇結(jié)果

樹脂的靜態(tài)吸附（A） 和解析（B） 見圖1。

由圖1可以看出，型號不同的大孔樹脂對伊豆錦葡萄皮花青素的吸附、解析效果存在一定差異。其中，ADS-8，AB-8，HPD-100A和SP207型樹脂對花青素的吸附率分別為86.70%，90.16%，87.34%，91.35%，AB-8和SP207型樹脂好于ADS-8和HPD-100A型樹脂 ， 且顯 著 性 差 異 （p＜0.05）； ADS-8， AB-8，HPD-100A和SP207型的解析率分別為65.42%，62.48%，67.37%，79.47%，SP207型的解析率最高且與其他3種樹脂差異顯著（p＜0.05）。結(jié)合兩圖比較可知SP207型樹脂吸附和解析效果最好，SP207型樹脂是最合適的樹脂。

圖1 樹脂的靜態(tài)吸附（A） 和解析（B）

2.2 伊豆錦葡萄皮花青素穩(wěn)定性研究

2.2.1 光照對花青素穩(wěn)定性的影響

光照對穩(wěn)定性的影響見圖2。

圖2 光照對穩(wěn)定性的影響

由圖2可以看出，在前6 d保存率下降的比較明顯，后4 d較為平緩，保存時間越長，穩(wěn)定性越低。2 d后，普通光照、日光的花青素保存率分別為90%，87%，83%，且差異顯著（p＜0.05）。說明色素對于光照敏感、耐光性不好。光照會使花青素生成一種中間代謝產(chǎn)物，C4羥基會進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成2，4，6-三羥基苯甲酸等產(chǎn)物，促使花青素降解，因此在花青素溶液保存時要注意避光保存[8]。

2.2.2 溫度對花青素穩(wěn)定性的影響

溫度對花青素保存率的影響見圖3。

圖3 溫度對花青素保存率的影響

由圖3可以看出，反應(yīng)5 h后，在4℃，室溫，40，60，80℃的保存率分別為83.4%，74.4%，74.1%，65.0%，52.5%。根據(jù)數(shù)據(jù)可知，溫度對花青素影響很大，花青素的保存率會隨著溫度的升高而降低，這是因為當(dāng)溫度升高時，花青素溶液的平衡會朝著生成無色查爾酮的方向進(jìn)行，從而導(dǎo)致花青素的降解和褪色[9]，因此花青素保存時應(yīng)該避免高溫。

2.2.3 pH值對花青素穩(wěn)定性的影響

pH值對花青素保存率的影響見圖4。

圖4 pH值對花青素保存率的影響

由圖4可以看出，pH值不同，花青素的保存率也不同。在pH值2～3內(nèi)，吸光度值較大。在不同酸堿條件下，溶液顏色也會顯現(xiàn)出明顯差別，當(dāng)溶液是堿性的時候呈現(xiàn)藍(lán)色，在中性的時候呈現(xiàn)紫色，在酸性溶液中呈現(xiàn)紅色。據(jù)文獻(xiàn)記錄，當(dāng)pH值小于2時，花青素主要是以紅色的2-苯基苯并吡喃陽離子存在，當(dāng)pH值小于8時，主要是以無色的甲醇假堿或查爾酮存在，當(dāng)pH值大于8時主要是以藍(lán)色的離子化醌式堿的形式存在[10]。

2.2.4 金屬離子對花青素穩(wěn)定性的影響

金屬離子對花青素保存率的影響見圖5。

由圖5可以看出，10 mmol/L的鉀離子對花青素的穩(wěn)定性影響不大，5 h后保存率依然為86%；1 mmol/L的鉀離子、鈣離子和鈉離子對花青素的穩(wěn)定性均有一定影響，反應(yīng)5 h后保存率依然在60%以上。三價鐵離子和二價鐵離子對花青素的穩(wěn)定性有明顯的破壞作用，隨著時間的延長，花青素的保存率明顯下降，且濃度高的保存率更低。鋁離子則有明顯的增色效應(yīng)，1 mmol/L和10 mmol/L的鋁離子均增強(qiáng)了花青素溶液的保存率，而且10 mmol/L的保存率略高于1 mmol/L。

圖5 金屬離子對花青素保存率的影響

2.2.5 氧化劑對花青素穩(wěn)定性的影響

H2O2對花青素保存率的影響見圖6。

圖6 H2O2對花青素保存率的影響

由圖6可以看出，H2O2對葡萄皮花青素的穩(wěn)定性有很大的影響，加入過氧化氫的花青素溶液的保存率均低于對照組，反應(yīng)2 h后H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，1.0%，2.0%，3.0%時，花青素溶液的保存率分別為86%，85%，83%，83%，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，保存率在下降。反應(yīng)5 h后保存率分別為71%，70%，69%，61%。由此可見，H2O2會使花青素的保存率快速下降。可能是由于H2O2可直接親核進(jìn)攻花青素的C位，使花青素開環(huán)生成查爾酮，查爾酮進(jìn)一步降解生成各種無色的酯類物質(zhì)[8]。

2.2.6 還原劑對花青素穩(wěn)定性的影響

維C對花青素保存率的影響見圖7。

圖7 維C對花青素保存率的影響

由圖7可以看出，維C加速花青素的降解，使花青素保存率降低，對花青素穩(wěn)定性有一定的影響。1 h后維C質(zhì)量濃度為0.04，0.08，0.16，0.32 g/L時花青素溶液的保存率分別為87%，86%，88%，87%；5 h后維C質(zhì)量濃度為0.04，0.08，0.16，0.32 g/L時，花青素溶液的保存率分別為67%，64%，63%，52%，隨著質(zhì)量濃度的增大，花青素溶液的保存率下降，且加入抗壞血酸后花青素的保存率均低于對照組，可見抗壞血酸對花青素有一定的影響。

3 結(jié)論

伊豆錦葡萄皮花青素溶液最大吸收峰為波長543 nm處，伊豆錦葡萄皮中色素的色價為6.7。大孔樹脂SP207對伊豆錦葡萄皮中的花青素具有良好的吸附和解析性能，純化效果非常理想。伊豆錦葡萄皮花青素溶液在不同pH值下顏色有所不同，pH值在2.2～3.0時花青素水溶液為紅色，pH值4.0時為淡黃白色，pH值5.0時為黃色，pH值6.0時為紅紫色，pH值7.0～8.0時為暗蘭紫色。高溫、光照、氧化劑和還原劑都會破壞花青素的穩(wěn)定性。Fe3+，F(xiàn)e2+使其保存率明顯降低，10 mmol/L的鉀離子對花青素的穩(wěn)定性影響不大，1 mmol/L的鉀離子、鈣離子和鈉離子對花青素的穩(wěn)定性均有一定影響，Al3+對花青素穩(wěn)定性有增強(qiáng)作用。避光、低溫、低pH值，加入Al3+均有利于提高花青素的穩(wěn)定性。