貴州省黔南地區(qū)豬源腸球菌的分離鑒定及其耐藥性分析

羅致茜 ， 呂世明 ， 譚艾娟 ， 董保豫 ， 猶銀俊 ， 林 習 ， 楊睿智 ， 鄭汝青 ， 周 玲

(1.貴州大學動物科學學院 ， 貴州 貴陽 550025 ； 2.貴州大學生命科學學院 ， 貴州 貴陽 550025 ； 3.黔南州動物疫病預防控制中心 ， 貴州 都勻 558000)

腸球菌(Enterococcus)屬腸球菌屬，為革蘭陽性球菌，廣泛分布于環(huán)境及人和動物腸道內，是人類和動物腸道正常菌群的一部分。腸球菌為條件致病菌，在正常條件下不致病，但是隨著畜牧業(yè)中免疫抑制劑及抗菌藥物的廣泛使用，腸球菌已成為重要的條件致病菌，臨床腸球菌所致感染性疾病逐年增多[1-2]，感染發(fā)生率正在逐年上升，可引起泌尿道感染、敗血癥及心內膜炎等多種疾病。據(jù)中國細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)數(shù)據(jù)顯示，中國細菌耐藥性檢測中多藥耐藥的腸球菌在臨床已并不少見[3-5]。大量的抗菌藥物用于動物疾病的預防與治療，對細菌的耐藥性產(chǎn)生巨大的選擇壓力，養(yǎng)殖場已經(jīng)成為耐藥菌產(chǎn)生的主要地方之一，并且腸球菌存在通過食物鏈傳播并轉移耐藥基因的風險[6]。我國獸醫(yī)臨床上已經(jīng)在雞、鴨、綿羊、仔豬等動物中分離出腸球菌，由此可見動物源腸球菌耐藥的現(xiàn)狀形勢嚴峻，有必要對其耐藥性進行監(jiān)測，及時分析動物源腸球菌的耐藥性，對養(yǎng)殖業(yè)中腸球菌的臨床抗菌藥物的用藥具有指導意義。本試驗針對貴州省黔南地區(qū)部分豬場分離的腸球菌的耐藥性進行研究，為貴州省腸球菌的控制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2019年1月采集于貴州省黔南地區(qū)10個豬場共219份肛門拭子樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 Cary-Blair氏運送培養(yǎng)基、腸球菌肉湯、腸球菌顯色培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂，均購自青島海博生物技術有限公司；DNA Marker 2 000，購自天根生化科技有限公司；2×TaqPCR Master Mix，購自康為世紀生物科技有限公司；甘油、Gold view Ⅰ型核酸染料，均購自北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖，購自西班牙Sigma公司；50×TAE緩沖液，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 主要藥品 青霉素、阿莫西林、頭孢噻呋、頭孢西丁、苯唑西林、慶大霉素、多西環(huán)素、氧氟沙星、磺胺異噁唑、復方新諾明、氟苯尼考、紅霉素、克林霉素、替米考星、利奈唑胺、萬古霉素、金霉素，均購自大連美侖生物技術有限公司。

1.1.4 儀器設備 LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海賀德試驗設備有限公司)；ST16R高速冷凍離心機(Thermo Fisher公司)；細菌濁度儀WGZ-XT(杭州齊威儀器有限公司)；T20型雙槽梯度PCR儀(杭州朗基科學儀器有限公司)；電泳儀JY600(北京君意東方電泳設備有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 采樣 將豬肛門拭子置于滅菌的Cary-Blair氏運送培養(yǎng)基，運送至實驗室。

1.2.2 預增菌 將一次性采樣豬肛門棉拭子取出，置于滅菌裝有腸球菌肉湯的2 mL EP管中，37 ℃培養(yǎng)16～20 h。

1.2.3 腸球菌顯色培養(yǎng)基分離 取預增菌液一環(huán)，劃線于腸球菌顯色培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單個紫色可疑菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂進行純化，然后制成25%甘油菌保種。

1.2.4 鑒定 參照王熙楚等[7]對腸球菌的分子鑒定方法，腸球菌屬的高度保守的tuf基因組片段的特異性引物序列：上游：5′-TACTGACAAACCATTCATGATG-3′；下游：5′-AATTCGTCACCAACGCGAAC-3′，引物由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成。

細菌DNA模板制備：參照孫碩[8]采用煮沸法提取細菌DNA作為模板。

PCR擴增：15 μL PCR反應體系：2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL，ddH2O 5.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL。擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

擴增產(chǎn)物電泳：PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含核酸染料)100 V電壓下電泳40 min后成像檢測。

1.2.5 藥敏試驗 按照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)[9]推薦的微量肉湯稀釋法進行最低抑菌濃度(MIC)測定，并按照2013年CLSI發(fā)布的獸醫(yī)藥物敏感性試驗標準—《動物源細菌抗菌藥物敏感性試驗紙片法和稀釋法執(zhí)行標準(VET01-A4)》和附表(VET01-S2)[10]進行結果判斷，其中慶大霉素按CLSI規(guī)定的高水平耐氨基糖苷類耐藥判定標準。質控菌為腸球菌標準菌株ATCC 29212。

2 結果

2.1 腸球菌的分離鑒定 從10個豬場采集的219份肛門拭子，經(jīng)增菌、純化、鑒定，共分離出132株腸球菌，分離率60.27%。腸球菌在腸球菌顯色培養(yǎng)基上的典型菌落為紫色，其他菌顯無色、黃色。PCR鑒定結果見圖1。

圖1 貴州省黔南地區(qū)豬源腸球菌PCR鑒定結果

2.2 藥敏試驗 結果見表1，132株腸球菌對青霉素、阿莫西林、頭孢噻呋、頭孢西丁、苯唑西林、慶大霉素、多西環(huán)素、氧氟沙星、磺胺異噁唑、復方新諾明、氟苯尼考、紅霉素、克林霉素、替米考星、利奈唑胺、萬古霉素、金霉素共17種抗菌藥物敏感性有較大差異，其中對克林霉素、磺胺異噁唑、復方新諾明、紅霉素耐藥最嚴重，耐藥率為100%；對頭孢西丁、頭孢噻呋、替米考星、苯唑西林、多西環(huán)素、金霉素、氧氟沙星、氟苯尼考、青霉素、利奈唑胺、阿莫西林、慶大霉素耐藥率分別為99.24%、99.24%、99.24%、97.73%、96.97%、94.70%、84.09%、83.33%、73.47%、69.70%、63.64%、34.09%；對萬古霉素的耐藥率最低(30.30%)。

結果顯示，對磺胺類(磺胺異噁唑、復方新諾明)、大環(huán)內酯類(紅霉素)、林可霉素類(克林霉素)的耐藥率均為100%；有84株腸球菌對3種β-內酰胺類藥物(青霉素、阿莫西林、苯唑西林)均耐藥，耐藥率為63.64%；第2代頭孢(頭孢西丁)與第3代頭孢(頭孢噻呋)的耐藥率均為99.24%；大環(huán)內酯類(紅霉素、替米考星)與四環(huán)素類(多西環(huán)素、金霉素)的耐藥率相差不大。

表1 黔南地區(qū)132株豬源腸球菌對17種抗菌藥物的耐藥性結果

2.3 腸球菌多重耐藥譜 對臨床分離的132株腸球菌進行多重耐藥分析，如圖2所示，所有菌株均為多重耐藥菌 (multidrug-resistant organisma，MDROs)，多重耐藥譜以耐17種和15種藥物為主，分別達30.30%(40株)和29.55%(39株)，至少都對4種藥物耐藥。

3 討論

抗菌藥物的過度使用是腸球菌耐藥性增加的重要因素。腸球菌因細胞壁厚，對有些抗菌藥物天然耐藥，且容易獲得性耐藥，耐藥問題日趨嚴峻。近些年來，因為耐藥菌株不斷增多以及新型耐藥菌株的出現(xiàn)，使得臨床對腸球菌預防與治療變得更加棘手[11]。

圖2 豬源腸球菌的多重耐藥菌株

本試驗分離的132株腸球菌對克林霉素、磺胺異噁唑、紅霉素、復方新諾明4種藥物耐藥最嚴重，耐藥率均為100%，臨床不建議使用；對頭孢西丁、頭孢噻呋、替米考星、苯唑西林、多西環(huán)素、金霉素、氧氟沙星、氟苯尼考、青霉素、利奈唑胺、阿莫西林、慶大霉素耐藥率依次降低；對萬古霉素的耐藥率最低為30.30%。與河南省、江蘇省、銀川等部分地區(qū)[12-14]相比，耐藥率均升高，表明不同地區(qū)腸球菌對抗菌藥物的耐藥性程度不同，卻也有上升的趨勢。

利奈唑胺與萬古霉素在獸醫(yī)臨床上都禁止使用，利奈唑胺是第1個噁唑烷酮類抗菌藥，2000年在美國首次上市，2007年于我國正式上市，人醫(yī)上主要用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和萬古霉素耐藥腸球菌等[15]。對于獸醫(yī)臨床不使用的利奈唑胺與萬古霉素，在本試驗中，利奈唑胺的耐藥率為69.70%，萬古霉素耐藥率為30.30%。國內已有報道表明，豬源分離糞腸球菌對萬古霉素存在一定程度的耐藥率。楊龍斌等[16]對江淮地區(qū)分離的40株豬源腸球菌的耐藥性分析表明，其對萬古霉素敏感率達72.0%以上。錢曉璐等[17]對豬源分離糞腸球菌的耐藥性分析表明，40株糞腸球菌中有4株對萬古霉素耐藥，其中2株表現(xiàn)對萬古霉素高度耐藥。顧欣等[18]對10個規(guī)模化養(yǎng)豬場分離的133株糞腸球菌進行藥敏試驗，表明分離菌對萬古霉素的耐藥率為3.01%。王送林等[19]對湖南豬源糞腸球菌的耐藥性分析表明，42株分離糞腸球菌對萬古霉素的耐藥率高達31%。萬古霉素耐藥腸球菌(Vancomycin-resistant enterococcus，VRE)對人類生命的威脅在逐年增加，根據(jù)本試驗結果，養(yǎng)殖場耐萬古霉素的腸球菌的產(chǎn)生和傳播不容忽視，且萬古霉素的耐藥水平較高，應避免使用。

近年來，由于養(yǎng)殖場臨床抗生素的大量使用，腸球菌的耐藥性也逐漸增強，高水平氨基糖苷類耐藥菌株(HLAR)、萬古霉素耐藥菌株(VRE)以及多重耐藥菌株(MDROs)的出現(xiàn)，給臨床治療帶來很大的困難和挑戰(zhàn)，應充分了解和掌握腸球菌的耐藥情況，根據(jù)藥敏試驗結果制訂相應的給藥方案，合理使用抗菌藥物，從而減少腸球菌耐藥菌株的產(chǎn)生，對控制腸球菌傳播具有重要意義。