運輸應激對小鼠腎臟顯微結構及熱休克蛋白表達的影響

彭侃霖 ， 伍 鋼 ， 吳青青 ， 王安平 ， 肖 鵬 ， 鄭文亞,2,3

(1.宜春學院生命科學與資源環境學院 ， 江西 宜春 336000 ; 2.江西省高等學校硒農業工程技術研究中心 ， 江西 宜春 336000 ; 3.江西綠科農牧科技有限公司 ， 江西 宜春 336000)

隨著國內畜禽養殖業的發展，朝著規模化、集約化邁進，大規模的畜禽運輸已必不可少，但運輸中應激反應會導致動物生產性能降低，如母畜流產，產奶量下降，動物源性食品的口感下降，如產生白肌肉(PSE肉)、黑干肉(DFD肉)，嚴重的應激反應甚至可導致動物死亡，這些都會給養殖場帶來巨大的損失，因此降低運輸過程中的應激反應已刻不容緩。

在動物運輸過程中饑渴、高溫、噪聲會促進多種應激激素的分泌，降低機體免疫力，影響腎臟的功能。腎臟是水鹽代謝的中心，具有保水、清除代謝產物、維持電解質平衡以及內分泌功能，保證機體內環境的穩定。運輸過程中，腎臟生化反應異常進行，大量活性氧自由基通過氧化應激作用損傷腎臟[1]，影響機體的代謝水平。

熱休克蛋白是動物體在應激原刺激下產生的一類在機體廣泛分布且高度保守的蛋白質，它可折疊、組裝、調節和降解蛋白質，在對抗環境壓力方面發揮著重要的作用[2]。目前關于熱休克蛋白家族的研究重點集中在熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSP)27、70和90(HSP27、HSP70和HSP90)中，本試驗以小鼠為實驗動物，模擬運輸應激對腎臟的損傷，探究HSP27、HSP70和HSP90三種熱休克蛋白在小鼠腎臟的分布、表達量，為降低畜禽運輸應激提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 運輸應激模型的建立及處理方法 32只8～9周齡 的ICR雄鼠(購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)，分為對照組和運輸應激組，每組各16只， 處理前禁食限水，對照組于25 ℃下不處理，運輸應激組則在35 ℃搖床160 r/min處理2 h，模擬夏季畜禽運輸應激。應激處理結束后，處死小鼠，取小鼠腎臟，一部分于4%多聚甲醛中固定，另一部分迅速浸入液氮速凍待用[3]。

1.2 主要試劑 蘇木精、伊紅染液，均購自北京夢怡美生物科技有限公司；小鼠SP免疫組織化學檢測試劑盒及濃縮型DAB，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；一抗HSP27(ab79868)、HSP70(ab5439)、HSP90(ab13492)和羊抗鼠酶標二抗(ab6789)，均購自Abcam公司；Mouse Anti-β-actin內參蛋白(BM0627)、彩色預染蛋白Marker(AR1113)，均購自博士德生物工程有限公司；4×Protein loading buffer(AI11800A)，購自TaKaRa Bio公司；HRP-ECL化學發光試劑盒(A149691)，購自GE Healthcare公司。

1.3 病理學觀察 對在4%多聚甲醛溶液中放置48 h以上的組織塊流水沖洗24 h以上，經脫水、透明、浸蠟、包埋后制備石蠟組織切片，37 ℃過夜后對切片進行H.E.染色，在光學顯微鏡下觀察腎臟的病理學變化，做好記錄并及時拍照。

1.4 免疫組織化學檢測 切片經二甲苯脫蠟、梯度酒精、微波抗原修復后，根據小鼠SP免疫組織化學試劑盒說明書進行操作，HSP27、HSP70、HSP90分別按照1∶800、1∶400和1∶800比例進行稀釋，陰性對照用PBS代替一抗。DAB顯色，蘇木精染核，經過分化、返藍、脫水、透明、封片后進行觀察和拍照，有黃色或者棕色出現視為有陽性反應。

1.5 Western Blot檢測 取腎臟經過研磨、蛋白裂解和抽提后制備蛋白提取液，采用BCA法測定總蛋白濃度，將對照組和運輸應激組的總蛋白濃度調節一致。上樣前制備好分離膠和濃縮膠，同時按比例往蛋白提取液中加入4×Protein loading buffer制成上樣蛋白液，95 ℃變性蛋白10 min，每組加樣孔按照對照組、運輸應激組順序上樣，每次上樣2組，進行SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h，取凝膠孵PVDF膜濕轉1 h，取膜用TBST漂洗后封閉2 h，將膜剪成適當大小后TBST漂洗3次，10 min/次，分別加入一抗[HSP27(1∶5 000稀釋)、HSP70(1∶1 000稀釋)和HSP90(1∶1 000稀釋)]和內參蛋白(1∶500稀釋)，在4 ℃垂直混合儀下孵育16～18 h，TBST漂洗3次， 10 min/次，二抗(1∶5 000稀釋)孵育2 h，TBST漂洗3次，10 min/次。最后將PVDF膜按照HRP-ECL化學發光試劑盒的說明書用化學發光成像系統(Amersham Imager 600)進行成像、拍照。

1.6 圖像與數據分析 用Image J軟件對采集的圖片進行分析，將目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值記為測試值。用SPSS 18.0軟件進行數據分析，結果記為平均數±標準差，P<0.05表示差異顯著，P>0.05 表示差異不顯著。

2 結果

2.1 運輸應激小鼠腎臟的顯微病理變化 與對照組(見中插彩版圖1A)相比，運輸應激組腎小管管腔狹窄，結構破壞，小管與小管之間的界限不清，部分小管之間發生融合，管狀結構消失，上皮細胞發生彌漫性顆粒樣變性，細胞排列疏松，間隔增大，胞核腫大，染色質濃縮、碎裂，細胞質出現大量細小顆粒乃至空泡化，管腔內可見粉紅色物質(見中插彩版圖1B)。腎間質淋巴細胞浸潤，血管充血，少量紅細胞滲出至組織中(見中插彩版圖1C)。

2.2 運輸應激對腎臟3種HSPs表達的影響 如中插彩版圖2A、2B所示，HSP27蛋白在運輸應激組腎小球系膜細胞、腎小囊壁層上皮細胞、腎小管上皮細胞、血管內皮細胞和腎間質細胞有陽性反應，主要在胞質表達，對照組腎小囊壁層上皮細胞和腎小球系膜細胞無表達，其他部位表達情況與運輸應激組相似。如中插彩版圖2C、2D所示，HSP70蛋白在對照組和運輸應激組腎小管上皮細胞胞質中均有表達，運輸應激組在集合小管和遠曲小管的表達明顯要強于對照組，血管內皮細胞也有表達。見中插彩版圖2E、2F所示，HSP90在運輸應激組小鼠腎小球和腎小管無表達，而對照組腎小管有表達。

2.3 小鼠腎臟中3種HSPs在運輸應激中表達量的變化 如圖3所示，運輸應激組和對照組HSP27蛋白表達量無顯著差異(P>0.05)；運輸應激組HSP70蛋白表達量明顯高于對照組(P<0.05)；與對照組相比，運輸應激組HSP90蛋白表達量明顯下降(P<0.05)。

圖3 小鼠腎臟中3種HSPs的表達量變化

3 討論

在運輸畜禽過程中，封閉的車廂內擁擠、濕熱，動物容易脫水，抗利尿激素分泌增加，腎小管對水、鈉的吸收增強，尿鈉減少，體內代謝產物排出存在障礙，可能引起如代謝性酸中毒和氮質血癥等疾病。此外運輸過程中的高溫、擁擠、噪聲以及生活環境改變會促進腎上腺糖皮質激素大量分泌，機體血糖濃度應激性升高。有研究報道,在高糖條件下培養的腎小管上皮細胞株HK-2中，存在自噬障礙[4-5]。在高糖條件下，腎小管上皮細胞線粒體發生病變[6]，異常增多的ROS會導致腎小管上皮細胞發生凋亡[7-8]，而由于應激使得機體天然的抗氧化劑如抗氧化酶T-SOD、CAT和GSH-Px損耗嚴重，細胞對抗ROS能力下降[9]，導致腎小管結構被破壞[10]。本試驗表明，模擬夏季畜禽運輸應激會造成小鼠腎小管上皮細胞變性和壞死，間質充血和出血，淋巴細胞浸潤，影響腎臟水鹽代謝功能。

誘導型熱休克蛋白70作為HSP70家族中的重要一員，被證實在腎小管和集合管的上皮有表達[11]。HSP70可抑制轉化生長因子β，促使Smad2/3蛋白磷酸化并阻斷其核移位，降低腎小管上皮間充質細胞異常轉化率，使腎小管間質纖維化受到抑制[12-13]。在腎小管進行原尿重吸收時，其髓質部受到高滲環境脅迫，HSP70的表達量增加，增強了髓質細胞對高濃度細胞外鹽的適應力，降低細胞在環境壓力下發生變性甚至破壞的可能性[14-15]。此外，HSP70存在損傷抑制作用[16]，一方面HSP70可上調MEK/ERK信號通路，激活細胞外調節蛋白激酶磷酸化反應，抑制氧化應激反應[17]；另一方面HSP70可抑制應激激酶磷酸化，減少炎性細胞因子的合成，降低細胞凋亡[18]。這些研究充分說明，在對抗環境應激脅迫、抑制細胞凋亡和維持細胞正常功能方面，HSP70扮演了不可或缺的角色。本試驗發現，HSP70在運輸應激組小鼠腎臟的表達要顯著高于對照組，這表明高水平的HSP70與機體維持正常水鹽平衡有關。

HSP90在腎臟中主要分布在腎小管遠端和集合管髓質段，通過協作機制逐步募集靶蛋白(如HSP70)并形成多伴侶復合物，這些復合物在應激條件下可調節信號轉導并防止未折疊蛋白聚集[19-20]。HSP90還與一些病理反應有關，通過CD14/TLR2和CD14/TLR4受體復合物介導的信號轉導途徑誘導炎性細胞因子參與炎癥反應[21]。本試驗結果表明，在模擬運輸過程中，與對照組相比，HSP90在小鼠腎臟的表達明顯下降，這可能與高強度運輸應激下HSP90的抑制作用有關。此外，在本試驗中運輸應激組和對照組HSP27的表達未出現顯著差異，具體的機理還需要進一步的研究。

運輸應激對小鼠腎臟特別是腎小管造成了較明顯的病理損傷，這對維持水鹽平衡具有消極影響，而HSP70表達上升，HSP90表達減弱，在一定程度上緩解這種影響，保持動物機體內環境穩定，降低運輸應激對動物生產性能的影響。