5種布魯氏菌病競爭ELISA抗體檢測試劑盒的比較

虞一聰 ， 桂平雄 ， 倪柏鋒 ， 王雅婷 ， 董建斐 ， 周 蕾 ， 柴 娟 ， 謝榮輝 ， 趙靈燕 ， 徐 輝

(浙江省動物疫病預防控制中心 ， 浙江 杭州 311199)

布魯氏菌病(Brucellosis,簡稱布病)是由布魯氏菌屬細菌引起牛、羊、豬、鹿、犬等哺乳動物和人類均可感染的一種人獸共患傳染病[1]。家畜感染后母畜常發生流產、早產、死胎等，公畜引起睪丸炎和附睪炎，導致繁殖能力和生產能力下降，并影響畜產品的質量和安全[2]。世界上170多個國家和地區先后發生人獸布病疫情[3]。20世紀50年代布病曾在我國廣泛流行，疫情嚴重地區人畜感染率達50%。20世紀80—90年代，由于防控力度加大，疫情降至歷史最低水平。自2000年以后，人獸共患布病疫情呈現逐年上升趨勢，對畜牧業構成了嚴重威脅[4]。動物布魯氏菌病診斷技術(GB/T 18646)在更新至2018年版后，增加競爭酶聯免疫吸附試驗(cELISA)作為血清學確診試驗。因試管凝集試驗(SAT)操作繁瑣、耗時，cELISA較SAT具有更高的特異性，且操作簡便、結果判定客觀。為此，作者以SAT作為參照方法，選擇5個廠家cELISA試劑盒進行比對試驗，根據檢測結果分析評價各試劑盒的檢測性能，為本實驗室選擇診斷用試劑盒提供參考。

1 材料與方法

1.1 血清 試驗血清選取背景清楚的血清共166份，其中牛血清111份，羊血清43份，豬血清12份，均于浙江省動物疫病預防控制中心實驗室-20 ℃保存。

1.2 試劑盒 5種布魯氏菌病抗體cELISA試劑盒，分別為A試劑盒(批號：18121701)、B試劑盒(批號：181120)、C試劑盒(批號：020161903)、D試劑盒(批號：20190619)、E試劑盒(批號：110718)，分別購自國內外5家公司。試管凝集試驗陰、陽性血清和抗原，均購自青島立見診斷技術發展中心。

1.3 主要儀器 酶標儀(Tecan Infinite F50)，洗板機(Tecan Hydro Speed)，恒溫箱(BINDER KB115)，離心機(Eppendorf 5424)，移液槍(Eppendorf)，微量振蕩器(海門其林貝爾MH-2)，生物安全柜(Thermo 1300 SERIES A2)，高壓滅菌器(TOMY SX-700)。

1.4 檢測方法

1.4.1 SAT 按動物布魯氏菌病診斷技術(GB/T 18646-2018)進行操作及結果判定。

1.4.2 cELISA 嚴格按照各試劑盒說明書進行操作并按要求判定結果，平行檢測所有血清樣品，且各試劑盒均在有效期內并試驗成立。

1.5 數據統計與分析 采用四格表法分別對各試劑盒檢測結果與SAT進行兩兩比較分析(表1)[5]，并利用SPSS 25.0、MedCalc 19.0等軟件將檢測結果進行統計與分析，采用χ2檢驗(McNemar法)對檢測樣品進行顯著性差異分析，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著，采用Kappa一致性檢驗對準確性進行分析。

表1 評價診斷試驗的四格表

1.6 成本-效果分析 本試驗以每份樣品檢測費用作為成本指標，以檢測時間(計孵育時間，加樣和洗板時間暫不計入)作為效果指標，檢測費用越少、檢測時間越短表明檢測效率越高。以每份樣品檢測費用的倒數與檢測時間的倒數之積作為單位成本檢測效率值，值越大表明試劑盒越好，通過比較單位成本檢測效率值來判定各試劑盒優劣。

2 結果

2.1 檢測結果 對實驗室留存的166份血清分別采用試管凝集試驗和5個廠家布病抗體cELISA試劑盒進行檢測，結果見表2、表3。

表2 試管凝集試驗檢測結果

表3 5種試劑盒cELISA檢測結果

2.2 檢測結果分析 5種試劑盒的敏感性、特異性、Youden指數及AUC值見表4。由表4可知，廠家A、B、D敏感性最高(100.00%)；廠家C特異性最高(99.14%)。廠家A的Youden指數和AUC值最大，分別為95.69%和0.978，表明其診斷準確性最好、診斷價值最高。5種試劑盒的陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)和陽性似然比(+LR)、陰性似然比(-LR)見表5。廠家A、C、E的PPV較高，表明檢出真陽性的概率更大；廠家A、B、D的NPV均為100.00，表明檢出真陰性的概率更大。廠家C的+LR最大，表明檢測結果陽性時為真陽性的概率最大，即證實疾病的能力最強。廠家A、B、D的-LR均為0.00，表明檢測結果陰性時為真陰性的可能性更大，即排除疾病的能力越好。

表4 5種cELISA試劑盒敏感性、特異性、Youden指數及AUC值結果

表5 5種cELISA試劑盒陽性預測值、陰性預測值和陽性似然比、陰性似然比結果

2.3 符合情況分析 5種試劑盒與SAT之間的符合情況見表6。McNemar檢驗結果顯示，5種試劑盒中廠家B和D的檢驗結果與SAT結果差異顯著(P<0.05)，廠家A、C和E的檢驗結果與SAT結果差異不顯著(P>0.05)；Kappa一致性檢驗分析表明，5種試劑盒的檢驗結果與SAT結果均有高度的一致性(0.790～0.930)，其中廠家A一致性最高(0.930)。

2.4 成本-效果分析 經成本-效果分析，5種cELISA試劑盒成本-效果分析比較見表7，其中廠家A的效率最高。

表6 5種cELISA試劑盒血清學檢測符合情況比較

表7 5種cELISA試劑盒成本-效果分析比較

3 討論

經檢測結果分析，廠家A、B、D敏感性最高，均為100%；廠家C特異性最高；5種試劑盒Youden指數均大于86%，表明診斷準確性較好；AUC值均大于0.9，表明診斷價值較高。廠家A、C和E PPV均大于90%，表明檢出真陽性的概率更大；5種試劑盒NPV均大于95%，表明檢出真陰性的概率較大。廠家C的+LR最大，表明證實疾病的能力最強；廠家A、B、D的-LR均為0，表明排除疾病的能力越好。經Kappa一致性檢驗分析表明，5種試劑盒與SAT結果均有高度的一致性，McNemar檢驗結果顯示，廠家A、C和廠家E與SAT結果差異不顯著(P>0.05)；廠家B和廠家D與SAT結果差異顯著(P<0.05)。經成本-效果分析，單位成本檢測效率值從高到低依次為A、C、B、E、D，表明廠家A的效果最好。

布病流行范圍廣、危害嚴重，是我國二類動物疫病。目前，常用的血清學診斷方法主要有RBT、SAT、CFT、iELISA和cELISA五種。由于敏感性和特異性的問題，它們都缺乏“理想檢測”的質量，而且沒有一種單一檢測方法可以適用于所有流行病學情況[6-7]。在日常檢測中以RBT和SAT為主，但2種檢測方法有較高的假陽性(15%以上)和假陰性(10%以上)，往往出現漏檢和誤檢[8]。世界動物衛生組織(OIE)陸生動物衛生法典中布病確診指定試驗為CFT或cELISA，但由于CFT操作復雜，每次檢測需準備紅細胞懸液和測定溶血素效價，費時費力成功率又低；而ELISA操作快速、簡單，檢測結果客觀又可靠，且有研究證明，cELISA具有更高的特異性[6]。因此，在布病血清學確診時亦可選擇cELISA。

此外，對于不同檢測目的，選擇適當的檢測策略(平行試驗或垂直試驗)也尤為重要。按照國家中長期動物疫病防治規劃和國家布病防治計劃，我國根據布病流行情況和防控策略實行區域化管理，全國多地主要采取“監測、撲殺、隔離、消毒”等相結合的綜合性防控措施。選擇合適的監測方案是防控布病的前提和關鍵，在監測、凈化過程中使用2種或2種以上檢測方法互相驗證，既可減少因誤殺造成的經濟損失，又可降低因漏檢造成布病傳播風險。有研究表明，RBT和iELISA組合進行平行試驗敏感性最好，SAT和cELISA組合進行垂直試驗特異性最好[9]。

國家正在積極推進“布病無疫區”和“布病凈化場群”的建設和評估驗收，尤其是對種畜、奶畜的布病凈化。在衛生疾病預防和治療領域，往往通過成本-效益分析(Cost-benefit analysis，CBA)和成本-效果分析(Cost-effectiveness analysis，CEA)來研究和評估方案、策略，從而選出最佳方案[10]。針對養殖場的布病凈化，從生物安全經濟學角度來看，選擇cELISA篩檢，前期檢測、人力成本會提高，但檢測結果可信度卻大大提升了，采取的針對性防控措施也更有成效，不僅可以剔除布病，還降低了養殖場生產維護成本，對控制布魯氏菌病流行，減少經濟損失，降低人感染疫病風險具有重要意義。