羊布魯氏菌病膠體金抗體檢測方法的建立

王海麗 ， 董炳梅 ， 李 芬 ， 許崇友 ， 王金良

(1.聊城職業技術學院農牧科技系 ， 山東 聊城 252000 ； 2.臨清潤林牧業有限公司 ， 山東 聊城 252000 ； 3.山東綠都生物科技有限公司 ， 山東 濱州 256600 ； 4.日照市東港區動物疫病預防控制中心 ， 山東 日照 276800 ； 5.山東省濱州畜牧獸醫研究院 ， 山東 濱州 256600)

布魯氏菌病(Brucellosis)是一種人獸共患病，嚴重危害人、畜健康，該病由布魯氏菌(Brucellasp.)引起，可導致豬、牛、羊等多種動物的不育、流產、關節腫大以及人的反復高熱、游走性疼痛，嚴重危害養殖業的健康發展，并造成了巨大經濟損失[1-2]。我國布魯氏菌病被列為二類傳染病，世界動物衛生組織(OIE)將其列為B類傳染病。

目前，我國布魯氏菌病的法定檢測方法是病原學檢測與血清學診斷方法，包括凝集試驗、補體結合試驗、PCR檢測和ELISA檢測等。凝集試驗與補體結合試驗均存在非特異性反應、假陽性或前帶現象等不足 ； PCR檢測與ELISA檢測等方法雖敏感性高、特異性強，但需要特殊儀器和實驗室環境。因此，以上方法不能滿足對布魯氏菌病的現場診斷與防控需求。膠體金免疫層析(GICA)技術是在免疫滲濾技術基礎上建立的一種簡易快速的免疫學檢測技術，適于臨床樣本的檢測[3]。

布魯氏菌細胞膜是一個三層膜的結構，其中OMP25在維持外膜結構穩定、細菌毒力等生物學特性方面起到重要作用，是布魯氏菌的重要膜蛋白之一[4]。本試驗在克隆表達布魯氏菌OMP25蛋白的基礎上，進一步開發了布魯氏菌GICA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及血清抗體 羊布魯氏菌陰性、陽性標準血清，均購自中國獸醫藥品監察所；大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門菌免疫血清、豬種布魯氏菌S2株、重組質粒pET-OMP25，均由濱州畜牧獸醫研究院制備保存。

1.1.2 主要材料與儀器 金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA，ProSpec公司)；膠體金噴點平臺系統(美國Biodot公司，型號：ZX1000)；可編程切條機(杭州峰航科技有限公司，型號：HGS201)；樣品墊(玻璃纖維)、硝酸纖維素膜(NCM)、吸水墊及背襯等試紙條組裝材料(Millipore公司)；GST標簽蛋白親和層析純化柱(Amersham Biosciences公司)；透射電子顯微鏡(Tokyo公司)；BCA法蛋白質定量檢測試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司產品)。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌外膜蛋白OMP25的表達與純化 將重組質粒pET-OMP25轉化BL21表達菌，37 ℃搖菌培養至OD600 nm值達0.6時，加IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，誘導表達16 h后，進行超聲裂解。表達的OMP25蛋白通過親和柱層析的方法進行純化，BCA法對純化后的蛋白濃度進行測定并進行凍干后保存。

1.2.2 膠體金的制備 在容積為500 mL錐形瓶中加入100 mL三蒸水，通過磁力加熱攪拌器的方式攪拌加熱至沸騰后，加入濃度為1%的HAuCl4溶液1 mL， 持續加熱2～3 min后，快速加入1.8 mL 濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液，待溶液變為亮紅色后，繼續攪拌加熱10 min，自然冷卻至室溫，用三蒸水補充體積至100 mL，2～8 ℃避光保存備用。

1.2.3 SPA標記pH的確定 溶液的pH對于膠體金顆粒吸附蛋白起到非常重要的作用，在實際的膠體金探針標記中，一般將標記體系的pH調整為高于被標記蛋白等電點(pI)0.5時，即pH=pI+0.5，在這種pH條件下蛋白帶正電，結合更穩定。

1.2.4 蛋白標記用量的確定 取10支1.5 mL Ep管，每支加入新制備的膠體金溶液1 mL，然后依次加入不同量的SPA蛋白，混勻后靜置5 min，依次向各管中加入0.1 mL 10%(w/v)的NaCl溶液(表1)，充分混勻后室溫靜置，2 h后觀察反應溶液顏色改變情況。當SPA加入量不足時，溶液為藍色；當SPA蛋白加入適量或過量，溶液則保持顏色不變，即為紅色。在探針制備過程中，蛋白的加入量一般為測定最小標記濃度的130%。

1.2.5 SPA蛋白膠體金標記物的制備 將新制備的20 mL膠體金溶液加入至50 mL燒杯中，用0.1 mol/L K2CO3溶液調整pH至1.2.3中確定的pH，緩慢攪拌的同時逐滴加入1.2.3中測定的1.3倍的SPA蛋白用量后，繼續攪拌30 min；再加入BSA至終濃度為1%，繼續攪拌30 min；2～8 ℃靜置2 h后，2 000 r/min離心15 min,棄沉淀,上清以8 000 r/min 再次離心45 min后，棄去上清液，取沉淀用標記洗滌液復溶至原體積；再次以10 000 r/min離心30 min后，用2 mL標記洗滌液復溶沉淀，2～8 ℃避光保存備用。

表1 SPA蛋白標記量的確定

1.2.6 樣品墊、金標墊制備 (1)樣品墊的制備：切割好的吸水墊用封閉液均勻浸潤后，取出平放于37 ℃干燥箱烘干，期間進行翻轉2～3次;(2)金標墊的制備：切割好的玻璃纖維膜浸潤封閉液后，放入37 ℃干燥箱烘干，期間進行翻轉2～3次,濃縮好的金標記物進行4倍稀釋后，均勻涂抹在已經進行過封閉的玻璃纖維膜上，進行真空冷凍抽干,抽干后的金標墊室溫密封存于干燥環境中，備用。

1.2.7 硝酸纖維素膜(NCM)的處理 將布魯氏菌標準陽性血清、OMP25蛋白抗原按照篩選的濃度，用點膜儀依次間隔4 mm在NCM上劃線，分別作為質控線、檢測線，37 ℃干燥后于10% BSA PBS溶液中37 ℃封閉15 min，再次干燥后備用。

1.2.8 膠體金試紙的組裝及結果判定 如圖1所示，將金標墊、樣品墊和吸水墊依次粘貼到硝酸纖NCM上，在NCM上已將檢測線和質控線進行了蛋白包被。

結果判定：試紙條的質控線(C線)和檢測線(T線)出現肉眼可見的紫紅色條帶，結果判為陽性；在有效時間內，T線顏色深淺與被檢血清中的抗體效價高低呈正相關。C線出現肉眼可見的紫紅色條帶，而T線無肉眼可見的紫紅色條帶，結果判為陰性。C線無條帶出現則判為無效檢測。如中插彩版圖2所示。

圖1 免疫層析試紙條示意圖

1.2.9 檢測樣品稀釋比例的確定 將布魯氏菌標準陽性、陰性血清，依次用0.85%生理鹽水進行10、20、40、60、80倍和100倍稀釋，樣本最佳稀釋倍數根據質控線和檢測線的顯色深度進行確定。

1.2.10 試紙條特異性檢驗 用研制的試紙條，依次檢測布魯氏菌陽性血清、布魯氏菌陰性血清、0.85%生理鹽水、大腸桿菌陽性血清、鏈球菌陽性血清、巴氏桿菌陽性血清、沙門菌陽性血清、葡萄球菌陽性血清。加樣量為100 μL，樣品稀釋倍數依據1.2.9中的結果進行，質控線顯色后10 min內進行結果判定。

1.2.11 試紙條敏感性比較 采用試紙條和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法，同時檢測倍比稀釋后的布魯氏菌標準陽性血清，比較2種方法的敏感性。

1.2.12 批內與批間的差異性檢測 對20份臨床血清樣品，用3個不同批次的試紙條分別進行布魯氏菌血清抗體檢測，比較分析試紙條檢測結果的批間差異性。隨機在一個批次的試紙條中取20個試紙條檢測卡，檢測同一份臨床血清樣品，評價試紙條檢測批內差異性。

1.2.13 保存期試驗 20組試紙條，每組10個，密封干燥包裝后，分別放在室溫和4 ℃保存3個月后，每個月取出5條試紙條，分別評價在室溫和4 ℃保存條件下，試紙條的特異性和敏感性的差異情況。

1.2.14 臨床檢測應用 隨機抽取320份從山東、河南等地的送檢的羊血清樣品，用本試驗研制的試紙條檢測布魯氏菌血清抗體。并與購買的布魯氏菌抗體ELISA試劑盒同時檢測隨機采集的20份臨床血清樣品，比較布魯氏菌抗體ELISA試劑盒和研制試紙條檢測結果的符合率。

2 結果

2.1 布魯氏菌 OMP25蛋白的表達及純化 將OMP25蛋白表達并純化后，進行SDS-PAGE檢測，結果顯示，蛋白大小約為25 kDa，蛋白濃度為1.41 mg/mL，且具有較高的純度(圖3)。

2.2 膠體金的制備 透射電鏡對制備的膠體金顆粒進行觀測，結果顯示，膠體金顆粒較為均一(圖4)；制備的膠體金溶液在400～600 nm紫外掃描得到最大吸收峰波長為520 nm(圖5)，膠體金顆粒直徑約為20 nm，與透射電鏡觀測值基本相符。

2.3 SPA蛋白標記膠體金溶液的pH 膠體金溶液的pH根據SPA的pI確定。SPA的pI為5.1，在膠體金探針制備中，膠體金調整為pH=pI+0.5。因此，膠體金溶液的pH確定為5.6。

圖3 OMP25蛋白的表達與純化

圖4 膠體金顆粒觀測圖

圖5 膠體金溶液在400～600 nm紫外掃描圖譜

2.4 SPA蛋白標記物濃度 從中插彩版圖6中顏色變化可以看出，加入6 μg SPA蛋白的7號管，再加入10%NaCl后，膠體金溶液顏色未有明顯變化，而8號管溶液的顏色變為藍色，表明7號管SPA量適宜或超量。在實際工作中，加入蛋白濃度一般為測定標記蛋白濃度的1.3倍，因此確定最佳SPA標記物的濃度為7.8 μg/mL。

2.5 檢測線和質控線包被濃度的確定 不同的檢測線和質控線、包被濃度，對試紙條的特異性和敏感性有很大的影響。經多次試驗，通過目測質控線和檢測線顯色清晰度，最終確定如下條件：檢測線包被條件：OMP25蛋白的濃度為1.20 mg/mL，點膜儀參數為Speed 40 mm/sec，1.0 μL/cm；質控線包被條件：羊IgG的濃度為1.60 mg/mL，點膜儀參數為Speed 40 mm/sec，1.0 μL/cm。

2.6 血清樣本稀釋倍數的確定 通過將多份不同倍數稀釋后布魯氏菌陰、陽性血清及大腸桿菌免疫血清、巴氏桿菌免疫血清、沙門菌免疫血清進行試紙條檢測，發現在進行20倍稀釋后，血清樣本在T線和C線上的顯色最為清晰。并且其他血清在進行稀釋檢測后，未發生非特異性反應。因此，確定20倍稀釋為待檢樣品最佳稀釋倍數。

2.7 試紙條特異性檢驗 結果見中插彩版圖7，由圖7可知，本試驗所制備的布魯氏菌抗體檢測試紙條具有很好的特異性，僅與布魯氏菌陽性血清發生反應，而與布魯氏菌陰性血清、0.85%生理鹽水、大腸桿菌陽性血清、巴氏桿菌陽性血清、沙門菌陽性血清、鏈球菌陽性血清、葡萄球菌陽性血清無交叉反應，重復3次，結果相同。可以進行下一步測試。

2.8 試紙條敏感性檢驗 用制備的試紙條和西班牙INgezim公司的布魯氏菌病抗體ELISA檢測倍比稀釋后的布魯氏菌陽性血清，結果表明，二者的最低檢出量均在1∶1 280～1∶2 560，證明2種檢測方法的敏感性相近(表2)。

2.9 試紙條臨床應用及符合率試驗 在臨床收集的320份樣本血清中，ELISA試劑盒檢測的布魯氏菌抗體陽性率為89.7%，膠體金試紙條檢測的抗體陽性率為85.9%。ELISA試劑盒共檢測出陽性287份，試紙條共檢測出陽性275份；用ELISA試劑盒檢測出的33份陰性樣品中，利用膠體金試紙條檢測出32份陰性樣品(表3)。相同樣本2種檢測方法的符合率為95.9%，敏感性為95.8%，特異性為97.0%。證明該膠體金試紙條的檢測結果是可靠的。

2.10 重復性試驗和保存期試驗 用3個不同批次的試紙條分別檢測20份臨床血清，結果完全一致，表明研制試紙條的批間差異較小。隨機從一批試紙條中挑取的20條，檢測同一份臨床血清樣品，檢測結果完全一致，說明試紙條批內無差異。保存期試驗表明，在4 ℃條件下保存9個月，試紙條的敏感性和特異性無明顯變化，敏感性在試紙條保存10個月時有所降低；在室溫條件下保存6個月，試紙條的敏感性和特異性無明顯變化，敏感性在試紙條保存7個月時有所降低。結果表明：試紙條在4 ℃條件下密閉保存9個月或室溫下保存6個月，其敏感性和特異性不發生改變，可用于臨床檢測。

表2 間接ELISA檢測、膠體金試紙條方法的敏感性比較

表3 臨床血清樣品檢測結果符合率比較

3 討論

GICA技術廣泛應用于各個領域，顯示出巨大的發展潛力和廣闊的應用前景[5]。目前根據膠體金標記物的不同反應模式有3種：間接法、夾心法及競爭法。間接法膠體金試紙條主要用于抗體檢測，夾心法膠體金試紙條主要用于大分子抗原的檢測；競爭法多用于小分子抗原的檢測。試紙條除了具有很好的敏感性和特異性之外，還具有操作簡便、反應快速、無需其他特殊反應試劑等優點，檢測結果易于判斷，10 min左右即可進行判定。

本試驗在克隆表達布魯氏菌OMP25蛋白的基礎上，建立了布魯氏菌抗體間接膠體金檢測方法。臨床應用表明，本試驗所制備的試紙條與進口的ELISA抗體檢測試劑盒符合率為95.9%，敏感性為95.8%，特異性為97.0%。證明膠體金試紙條的檢測結果是可靠的，可以代替ELISA、凝集反應與補體結合試驗等方法用于布魯氏菌抗體水平的檢測，可作為羊布魯氏菌的流行病學調查的工具。