2018年廣西7種鳥類的新城疫病毒病原學(xué)監(jiān)測(cè)和F基因遺傳進(jìn)化分析

曾婷婷 ， 謝麗基 ， 謝芝勛 ， 羅思思 ， 李 孟 ， 黃嬌玲 ， 張民秀 ， 張艷芳 ， 范 晴 ， 鄧顯文

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 ， 廣西 南寧 530001)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)可感染多種禽類，并引發(fā)以高致病性、高致死率為臨床癥狀的新城疫(Newcastle disease，ND)，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為規(guī)定的必須通報(bào)的烈性傳染病之一，同時(shí)我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其列為《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》優(yōu)先防控的重大動(dòng)物疫病之一。NDV可感染超過250種禽類和鳥類[1]，并且野鳥一直被認(rèn)為是NDV的天然儲(chǔ)存庫(kù)，攜帶NDV的個(gè)體通過排泄物和分泌物使易感動(dòng)物受到感染，成為家禽新城疫暴發(fā)的重要傳染源[2]。因此，監(jiān)測(cè)鳥類攜帶NDV的情況，了解NDV在鳥類當(dāng)中的感染率和基因型分布，有利于家禽的ND防控。本實(shí)驗(yàn)室于2018年度對(duì)廣西地區(qū)內(nèi)的鷓鴣、山雞、鵪鶉、珠頸斑鳩、斑鳩、野鴨和鴿子7種鳥類進(jìn)行了NDV的病原分離鑒定并對(duì)它們的F基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，為廣西地區(qū)內(nèi)的鳥類NDV的流行病學(xué)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料 核酸抽提試劑盒EasyPure?Viral DNA/ RNA Kit、膠回收試劑盒EasyPure?Quick Gel Extraction Kit、載體連接試劑盒pEASY?-Blunt Simple Cloning Kit，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RT-PCR試劑盒PrimeScriptTMII High Fidelity One Step RT-PCR Kit，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。引物由深圳華大基因股份有限公司合成。標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。SPF雞胚，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集 2018年在廣西境內(nèi)不同地區(qū)采集鷓鴣、山雞、鵪鶉、珠頸斑鳩、斑鳩、野鴨和鴿子7種鳥類的咽喉/泄殖腔棉拭子樣品共計(jì)904份，其中山雞158份，鴿子257份，鷓鴣153份，珠頸斑鳩71份，斑鳩49份，鵪鶉214份，野鴨2份。其中山雞、鴿子、鵪鶉為人工養(yǎng)殖鳥類，采集自活禽市場(chǎng)，鷓鴣、珠頸斑鳩、斑鳩和野鴨是野生鳥類，采集自廣西野生動(dòng)物救助中心。

1.3 病毒分離鑒定 將采集的鳥類咽喉和泄殖腔棉拭子，于含青鏈霉素的PBS中充分捻壓，并于4 ℃冰箱中靜置作用4 h后，3 000 r/min離心10 min，取上清接種9～11日胚齡SPF雞胚尿囊腔。雞胚于37 ℃孵育并收集24～96 h內(nèi)死亡或活胚的尿囊液。用血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)對(duì)尿囊液進(jìn)行初步鑒定。

1.4F基因的RT-PCR擴(kuò)增 設(shè)計(jì)4對(duì)引物擴(kuò)增NDVF基因，F(xiàn)GENE 1和FGENE 2擴(kuò)增產(chǎn)物拼接可得到CLASS Ⅰ NDVF基因全長(zhǎng)，F(xiàn)GENE 3和FGENE 4擴(kuò)增產(chǎn)物拼接可得到CLASS Ⅱ NDVF基因全長(zhǎng)。引物信息見表1。參照試劑盒說明書對(duì)HI鑒定為NDV陽性的尿囊液提取病毒RNA，分別使用4對(duì)引物擴(kuò)增NDVF基因。PCR產(chǎn)物回收后分別連接至pEASY?-Blunt載體，并轉(zhuǎn)化克隆至大腸桿菌。陽性克隆送至深圳華大基因股份有限公司測(cè)序。

1.5F基因同源性及遺傳進(jìn)化分析 利用Lasergene軟件拼接F基因并推導(dǎo)出NDV F0蛋白氨基酸序列，并對(duì)分離毒株與參考毒株序列進(jìn)行同源性分析。利用MEGA 6軟件對(duì)本試驗(yàn)分離毒株與參考毒株的F基因序列，進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，采用Maximum likelihood test的Kimura 2-parameter模型，Bootstrap值設(shè)定為1 000構(gòu)建系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離 2018年在廣西境內(nèi)采集7種鳥類的咽喉/泄殖腔棉拭子樣品，其中山雞、鴿子、鵪鶉為人工養(yǎng)殖鳥類，采集自活禽市場(chǎng)，由于飼養(yǎng)這些經(jīng)濟(jì)鳥類的養(yǎng)殖戶規(guī)模大小不一，養(yǎng)殖水平參差不齊，故無法統(tǒng)計(jì)它們是否曾經(jīng)接受過ND免疫。鷓鴣、珠頸斑鳩、斑鳩和野鴨是野生鳥類，采集自廣西野生動(dòng)物救助中心，未接受過ND免疫。采集鳥類拭子樣品時(shí)眼觀這些鳥類均為健康狀態(tài)。共采集7種鳥類的咽喉和泄殖腔拭子904份，經(jīng)過SPF雞胚病毒分離和HI試驗(yàn)，結(jié)果共有17份尿囊液為NDV HI試驗(yàn)陽性，其中鴿源NDV 3份(3/257，1.16%)，山雞源NDV 2份(2/158，1.26%)，鵪鶉源NDV 1份(1/214，0.46%)，鷓鴣源NDV 2份(2/153，1.30%)，斑鳩源NDV 5份(5/49，10.20%)，珠頸斑鳩源NDV 4份(4/71，5.6%)，野鴨未分離到NDV。將陽性尿囊液樣品分別命名為GX1801+來源～GX1817+來源，如GX1801Turtle dove。

2.2F基因擴(kuò)增和同源性分析 使用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的4對(duì)引物，對(duì)17份HI試驗(yàn)陽性尿囊液樣品中的NDVF基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增并測(cè)序。RT-PCR結(jié)果顯示，2株NDV出現(xiàn)CLASS Ⅰ NDV條帶，15株NDV出現(xiàn)CLASS Ⅱ NDV條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，F(xiàn)基因的開放閱讀框全長(zhǎng)均為1 662 nt，編碼553個(gè)氨基酸。利用DNASTAR Megalign對(duì)這17個(gè)F基因和參考毒株比對(duì)分析，17個(gè)毒株之間的核苷酸相似性為71.1%～100%，其中GX1801Turtle dove、GX1802Pigeon和GX1806Partridge的F基因核苷酸相似性為100%，與LaSota的核苷酸相似性為71.1%～99.8%，與經(jīng)典強(qiáng)毒F48E9的核苷酸相似性為71.5%～90.2%。根據(jù)F基因推導(dǎo)的氨基酸序列，F(xiàn)0蛋白裂解位點(diǎn)第112～117位的氨基酸序列，11株NDV的氨基酸序列為RRQKRF，符合NDV強(qiáng)毒分子特征。6株NDV的氨基酸序列為G/ER/KQG/ERL，符合NDV弱毒分子特征(表2)。

圖1 17株NDV F基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

表2 NDV F0蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸序列和基因型

2.3F基因的遺傳進(jìn)化分析 采用F基因全長(zhǎng)，與101個(gè)NDVF基因比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，4株NDV(1株斑鳩源，1株鴿源，1株鵪鶉源，1株山雞源)歸屬于CLASS Ⅱ基因Ⅰ型；2株NDV(1株鴿源，1株鵪鶉源)歸屬于CLASS Ⅰ基因1型；11株(4株斑鳩源，4株珠頸斑鳩源，1株鴿源，1株山雞源，1株鵪鶉源)歸屬于CLASS Ⅱ基因Ⅵ型。根據(jù)He等[3]和Dimitrov等[4]對(duì)CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV的分類方法和參考序列，與本文的11株CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV構(gòu)建的進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，GX1812Pigeon屬于Ⅵj亞型，其余10株屬于Ⅵk亞型(圖2)。

3 討論

一直以來，野鳥都被認(rèn)為是NDV的天然儲(chǔ)存庫(kù)，所以野鳥攜帶NDV的情況也備受關(guān)注。根據(jù)之前的流行病學(xué)報(bào)道，2005—2006年，李東偉[5]對(duì)黑龍江部分地區(qū)的野鳥攜帶NDV的調(diào)查結(jié)果為14份其中13份為CLASS Ⅱ基因Ⅶ型，1份為CLASS Ⅱ基因Ⅲ型。2012年李鳳勇[6]對(duì)向海地區(qū)的野鳥攜帶NDV調(diào)查發(fā)現(xiàn)22份NDV均屬CLASS Ⅰ。同年，張渭東[7]對(duì)秦嶺的野鳥進(jìn)行NDV流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，5份陽性樣品均為CLASS Ⅱ基因Ⅵb型NDV，與當(dāng)時(shí)流行的鴿源NDV屬同一分支。2014年，李勝楠等[8]從湖南長(zhǎng)沙、吉林省莫莫格保護(hù)區(qū)以及河北滄州等地分離到的7株野鳥源NDV，5株為CLASS Ⅱ基因Ⅰ型，2株為CLASS Ⅱ基因Ⅱ型。同年，李小陽[9]從湖南洞庭湖、吉林莫莫格國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)和吉林東北虎園分離到了17株野鳥源NDV,其中10株為CLASS Ⅱ基因Ⅰ型，7株為CLASS Ⅱ基因Ⅱ型。由此可見，CLASS Ⅱ基因Ⅰ型和CLASS Ⅰ NDV是長(zhǎng)期在野鳥中存在的，本實(shí)驗(yàn)室也在斑鳩中分離到CLASS Ⅱ基因Ⅰ型1株。同時(shí)，在養(yǎng)殖鳥類鴿子、山雞和鵪鶉也分離到了CLASS Ⅱ基因Ⅰ型和CLASS Ⅰ NDV。

然而，從斑鳩、珠頸斑鳩、鴿子、山雞和鵪鶉均分離到了分子特征為強(qiáng)毒特征的CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV，且比例很高(11/17)，尤其值得關(guān)注。提示鳥類可以感染攜帶強(qiáng)毒NDV而不發(fā)病。斑鳩和珠頸斑鳩不是候鳥，廣西的土雞養(yǎng)殖模式是山林，果林散養(yǎng)為主，鴨、鵝養(yǎng)殖模式是水塘散養(yǎng)為主，因此這2種鳥類的生活區(qū)域可能與禽類養(yǎng)殖地區(qū)長(zhǎng)期重疊，攜帶強(qiáng)毒NDV與養(yǎng)殖禽類長(zhǎng)期接觸。盡管目前仍然沒有雞、鴨、鵝感染CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV發(fā)病的報(bào)道，然而經(jīng)過長(zhǎng)期接觸，CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV會(huì)不會(huì)對(duì)這些禽類產(chǎn)生致病引起ND暴發(fā)，仍然未知，需要密切跟蹤關(guān)注。鴿子、山雞和鵪鶉為人工養(yǎng)殖鳥類，檢測(cè)出CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV是在養(yǎng)殖過程中感染攜帶，還是在活禽交易市場(chǎng)中感染攜帶，則需要更多的溯源采樣證實(shí)。

CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV自20世紀(jì)70—80年代被發(fā)現(xiàn)以來[10-11]，一直在不斷的流行演化。起初，鴿源NDV屬于基因Ⅵb亞型[12]，Xue等[13]在2015年吉林省的鴿子中分離到了Ⅵk亞型NDV。He等[3]對(duì)廣西2012—2018年的ND發(fā)病鴿群進(jìn)行病原分離和NDV進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)5株NDV屬于Ⅵj亞型，13株屬于Ⅵk亞型。對(duì)本次病原學(xué)監(jiān)測(cè)獲得的11株CLASS Ⅱ基因Ⅵ型NDV進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，其中10株屬于Ⅵk亞型，1株屬于Ⅵj亞型，并且在進(jìn)化關(guān)系上與廣西的鴿源NDV非常靠近。與本試驗(yàn)10株Ⅵk亞型NDV Blast結(jié)果最接近的廣東蒼鷺分離株Grey heron/Ch/GD/GZ333/2015[14]經(jīng)遺傳進(jìn)化分析，也屬于Ⅵk亞型；同一研究中的另外3株野鳥NDV分離株均與鴿源NDV親緣關(guān)系接近。說明這些鳥類和養(yǎng)殖鴿群一直存在著NDV互相傳播的現(xiàn)象，但是到底這些新的基因亞型是在野鳥體內(nèi)進(jìn)化得來傳播到鴿子還是在鴿子體內(nèi)進(jìn)化得來傳播到野鳥，未來這些基因亞型的致病性將如何發(fā)展，仍然未知。本實(shí)驗(yàn)室下一步也會(huì)對(duì)這些毒株進(jìn)行致病性試驗(yàn)和全基因組測(cè)序，同時(shí)也將對(duì)之前的病原學(xué)監(jiān)測(cè)獲得的毒株[15]進(jìn)行回顧性研究，以期對(duì)廣西地區(qū)的鳥類NDV有深入的理解。