2017—2018年河南省豬流行性腹瀉病毒S基因序列分析

趙攀登 ， 陳 益 ， 朱文龍 ， 冀夢瑤 ， 盧建洲 ， 王 巖 ， 劉靜靜 ， 朱 芳 ， 田 欣 ， 趙圣杰

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)藥學院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2.河南省動物疫病預防控制中心 ， 河南 鄭州 450000)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種急性高度接觸性腸道傳染病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水甚至死亡[1]。該病于1971年在英國首次暴發(fā)，隨后蔓延至多個國家和地區(qū)，呈現(xiàn)地方流行性[2]。2010年10月，中國南方暴發(fā)PED，疫情迅速蔓延至全國，隨后多個國家和地區(qū)均暴發(fā)PED，對全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。PEDV屬于I型冠狀病毒，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。PEDV基因組全長約28 kb，基因組從5′到3′依次為5′UTR- replicase(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3′UTR，其中S基因編碼纖突蛋白(S蛋白)[4-5]。研究表明，S蛋白在中和抗體產(chǎn)生、介導病毒和細胞結(jié)合以及細胞膜融合方面發(fā)揮著重要作用[5-7]。S蛋白在PEDV遺傳演化中有重要作用，S蛋白變異會引起PEDV毒力、宿主范圍等發(fā)生變化[8-9]。

近年來，河南省不斷暴發(fā)PED，導致大量仔豬死亡。因此，本試驗采集了河南省8個規(guī)模化豬場仔豬腹瀉樣品，并對6個PEDV陽性樣品進行S基因擴增、測序及遺傳進化分析，進一步了解河南省PEDV的流行及遺傳變異情況，為PED的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集和處理 80份仔豬腸道樣品于2017年10月—2018年2月采自河南省8個規(guī)模化豬場嚴重腹瀉產(chǎn)房仔豬，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 主要試劑 Agarose M、DL-2 000 DNA Marker、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit、Ultra GelRed(10 000×)，均購自Vazyme公司；TRIzol Plus，購自寶生物工程(大連)有限公司；乙醇、異丙醇、氯仿等試劑均為分析純。

1.3 引物設計與合成 在PEDVS基因保守區(qū)域設計1對引物，用于檢測PEDV。根據(jù)GenBank中CV777毒株設計擴增S基因引物，共設計4對相互重疊的引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列信息見表1。

表1 引物序列

1.4 病料處理、總RNA提取及RT-PCR檢測 取腸道樣品剪碎后加入10倍PBS，經(jīng)勻漿后反復凍融3次，12 000 r/min離心5 min，取上清，按照 TRIzol Plus操作說明書提取總RNA，用適量的DEPC水溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訰NA為模板，按照HiScript II One Step RT-PCR Kit操作說明書，用PEDV-F/PEDV-R進行RT-PCR檢測，分析河南省規(guī)模化豬場PEDV陽性率。

1.5S基因擴增及測序 以PEDV陽性樣品的RNA為模板，按照HiScript II One Step RT-PCR Kit操作說明書進行S基因擴增，反應體系：2×One Step Mix 25 μL，One Step Enzyme Mix 2 μL，上下游引物各2 μL，RNA模板3 μL，加去離子水至50 μL。反應條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s進行35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并經(jīng)純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.6 序列分析 采用MEGA 6.0軟件對獲得的6個S基因全長序列和GenBank發(fā)布的30個S基因序列進行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)遺傳進化樹。

2 結(jié)果

2.1 病料檢測及PEDVS基因擴增 從8個規(guī)模化豬場80份樣品中檢測出6個豬場60份樣品為PEDV陽性，陽性率為75%。選取6個規(guī)模化豬場的陽性病料，編號為1、2、3、5、6、7，從陽性病料中擴增S基因的4個片段，均獲得大小分別為1 358 bp、1 380 bp、1 321 bp和712 bp的片段，與預期結(jié)果相符(圖1)。經(jīng)測序和NCBI比對，獲得全長S基因，分別命名為1-S、2-S、3-S、5-S、6-S、7-S。

2.2 PEDVS基因序列分析 6株P(guān)EDVS基因核苷酸及推導的氨基酸同源性對比顯示，同源性分別是98.4%～99.9%和98.2%～100%，其中2-S和3-S之間氨基酸同源性最高，為100%，3-S和5-S之間氨基酸同源性最低，為98.2%。6株P(guān)EDVS基因與經(jīng)典毒株CV777之間的核苷酸及氨基酸同源性分別是93.7%～94.9%和92.4%～94.6%，在第59～62位有4個氨基酸(QGVN)插入，第140位有1個氨基酸插入(N)，在第160位有1個氨基酸缺失(G)，與其他PEDV參考毒株之間的核苷酸及氨基酸同源性分別是94.8%～98.9%和94.1%～99.2%，其中6-S與2002年韓國毒株Spk1之間氨基酸同源性最低，為94.1%，5-S與2015年中國毒株CH-CLC-01-2015(KR296682)之間氨基酸同源性最高，為99.2%。

2.3 PEDVS基因遺傳進化分析 將6株P(guān)EDVS基因與PEDV參考株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(見圖2)，結(jié)果顯示，本試驗獲得的6株P(guān)EDVS基因位于同一分支上，其中1-S、3-S、6-S和7-S親緣關(guān)系最近，并且與2015年中國毒株CH-CLC-01-2015(KR296683.1)親緣關(guān)系較近；2-S與2016年中國毒株GZMR(KX073610.1)、YZ2(KU237234.1)和2016年韓國毒株J3142(KP995064.1)親緣關(guān)系較近；5-S與2016年中國毒株CH-HNAY-14.7(KT989366.1)和CH-SCYA-2-201(KU97542.1)親緣關(guān)系最近。6株P(guān)EDVS基因與經(jīng)典毒株CV777(JN599150.1)均處于不同的分支上。

圖1 S基因4個片段RT-PCR擴增結(jié)果

3 討論

豬流行性腹瀉能夠引起不同階段的豬出現(xiàn)腹瀉、脫水等癥狀，尤其對產(chǎn)房10日齡內(nèi)的仔豬可引起較高的死亡率，嚴重危害世界養(yǎng)豬業(yè)，近年來豬流行性腹瀉發(fā)病依然頻繁[10-11]。盧冰霞等采集了廣西14個地區(qū)331個腹瀉樣品，PEDV檢測率為63.44%[12]。王二鑫等對河南省不同地區(qū)67份腹瀉樣品進行檢測，PEDV陽性率為64.2%[13]。趙麗等對河南省200份臨床腹瀉樣品進行檢測，PEDV陽性率為71.5%[14]。本試驗對發(fā)生新生仔豬腹瀉的8個規(guī)模化豬場進行采樣，共收集80份樣品，其中6個規(guī)模化豬場60份樣品均檢測出PEDV，說明PED的發(fā)病率較高，流行情況嚴重。經(jīng)調(diào)查，發(fā)生PED的6個規(guī)模化豬場均免疫過商品化豬流行性腹瀉疫苗，由此說明疫苗免疫或者母源抗體不足以保護仔豬抵抗PEDV流行毒株的感染。

S基因是PEDV重要的抗原基因，通過對PEDVS基因測序，可了解PEDV流行毒株的變化趨勢。

本試驗通過對河南省6個規(guī)模化豬場PEDVS基因全長進行擴增和測序，并進行序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，6株S基因核苷酸和氨基酸之間同源性較高，可能源自同一毒株。但是6株S基因和經(jīng)典毒株CV777同源性較差，并存在氨基酸的插入和缺失，即在第59～62位存在4個氨基酸(QGVN)插入，在第140位和第160位分別插入1個氨基酸(N)和缺失1個氨基酸(G)，與之前的研究報道相似。遺傳進化分析表明，6株S基因?qū)儆谕环种Вc2015年中國流行毒株、2016年中國毒株和韓國毒株親緣關(guān)系較近。但6株S基因與經(jīng)典毒株CV777(JN599150.1)、83P-5(AB548618)、DR13(DQ862099)等位于不同分支，親緣關(guān)系較遠。

本試驗明確了河南省PEDV的流行和遺傳變異情況，揭示了PEDV流行毒株與經(jīng)典毒株存在較大差異，可能是免疫失敗和PED發(fā)病的主要原因。本試驗為PED的監(jiān)測及防控提供了參考依據(jù)。