雞傳染性貧血病毒湖北分離株XH16全基因組序列分析

靳澤華 , 黃 英 , 王澤宇 , 張安定,4

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 湖北 武漢 430070 ； 2. 湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心 ， 湖北 武漢 430070 ； 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 湖北 武漢 430070 ； 4. 科技部動(dòng)物疫病聯(lián)合研究中心 ， 湖北 武漢 430070)

雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus,CAV) 是圓環(huán)病毒科、環(huán)病毒屬、單股環(huán)狀DNA病毒，對(duì)各年齡雞均易感，感染后可引起雞只貧血，并伴有淋巴組織萎縮，導(dǎo)致免疫抑制，嚴(yán)重危害了家禽養(yǎng)殖業(yè)[1]。2016年，湖北某家禽養(yǎng)殖場發(fā)生了疑似雞傳染性貧血病毒感染，該場5周齡肉雞黏膜蒼白，出現(xiàn)貧血癥狀，生長發(fā)育停滯。本實(shí)驗(yàn)室從病雞肝臟中分離到1株病毒并將其命名為CAV-XH16。本試驗(yàn)旨在分析雞傳染性貧血病毒分離株CAV-XH16的基因組特征，為雞傳染性貧血病毒分子流行病學(xué)研究和新型疫苗研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 被檢樣品來自于湖北某雞場的1只疑似雞傳染性貧血病毒感染的肉雞，該雞雞冠及黏膜蒼白，精神萎靡，生長發(fā)育遲緩。剖檢采集其肝臟勻漿保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要材料TransTaq?-T DNA Polymerase，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Ladder，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物合成 參照GB NY/T 1187-2006雞傳染性貧血病毒聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法，合成雞傳染性貧血病毒PCR鑒定引物CAV-JD-F和CAV-JD-R；基因組測序引物參照文獻(xiàn)[2]設(shè)計(jì)。引物序列如表1所示，所有引物序列均由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞胚，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司，并孵化成雞。

1.5 病毒PCR檢測 取病雞肝臟加入PBS充分研磨后，將研磨液反復(fù)凍融3次，12 000 g離心10 min， 取300 μL上清,加入1 mL苯酚氯仿異戊醇(25∶24∶1)抽提DNA，8 000 g離心5 min;取上層水相并加入2倍體積的異丙醇沉淀DNA,15 000 g離心5 min;棄上清，加入1 mL 70%乙醇,12 000 g離心5 min；棄上清，室溫干燥5 min后，加入50 μL超純水溶解DNA。取2 μL溶解的DNA作為模板，使用鑒定引物CAV-JD-F和CAV-JD-R進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，并將瓊脂糖凝膠電泳分離得到的條帶送北京擎科生物科技有限公司測序，比對(duì)測序結(jié)果。

1.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將80只SPF雞隨機(jī)分為2組，試驗(yàn)組50只，對(duì)照組30只。將1.5中所得的病雞肝臟研磨液反復(fù)凍融3次，12 000 g離心10 min，取上清。將上清用0.22 μm濾器過濾去除雜質(zhì)。試驗(yàn)組取100 μL過濾后的上清腹腔接種1日齡SPF雞。對(duì)照組腹腔接種100 μL PBS。接種后持續(xù)觀察雞只的精神狀況、發(fā)病和病死情況。在接種第21天時(shí)，分別剖檢試驗(yàn)組和對(duì)照組雞只，取出肝臟研磨，參照1.5中方法進(jìn)行PCR鑒定病毒。

1.7 組織病理學(xué)檢查 將10只1日齡SPF雞隨機(jī)分為2組，包括試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只，參照1.6中接種方法，試驗(yàn)組接種過濾后的上清，對(duì)照組接種PBS。接種第8天時(shí)將雞處死，進(jìn)行剖檢，并分離每只雞的胸腺、骨髓、法氏囊、肝、脾等組織器官，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片并用蘇木精和伊紅染色，封片后，顯微鏡下觀察并記錄病理變化。

1.8 全基因組序列測定及分析 以分離株的基因組為模板，分別用引物CAV-F1/CAV-R1、CAV-F2/CAV-R2和CAV-F3/CAV-R3擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的片段送北京擎科生物科技有限公司測序，并將測序結(jié)果運(yùn)用MEGA 7.0、Snapgene 2.5等軟件進(jìn)行拼接得到分離株的全基因組序列，并與GenBank上參考序列進(jìn)行比對(duì)和分析。

1.9 遺傳進(jìn)化分析 基于分離株的全基因組序列和VP1、VP2和VP3蛋白質(zhì)序列與GenBank上參考序列進(jìn)行比對(duì)和分析。運(yùn)用MEGA 7.0軟件，采用Kimura雙參數(shù)模型和1 000個(gè)自展值的鄰近方法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒的PCR檢測 以病雞肝臟研磨液提取的基因組為模板，用鑒定引物CAV-JD-F和CAV-JD-R進(jìn)行PCR，并將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，可見與預(yù)期符合的676 bp的條帶(圖1A)，將該條帶進(jìn)行測序，分析測序所得序列，結(jié)果表明，分離序列與GenBank上CAV參考序列相似性最高，表明分離株為雞傳染性貧血病毒，將其命名為CAV-XH16。

2.2 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將分離株CAV-XH16接種1日齡雞，檢測其致病性。回歸試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組約50%的雞只在感染后7～16 d出現(xiàn)明顯貧血表現(xiàn)，且有精神沉郁、厭食等癥狀，在此期間共有26只雞死亡。隨后，試驗(yàn)組其他雞只狀態(tài)逐漸恢復(fù)。對(duì)照組雞只沒有明顯的臨床癥狀。分別取試驗(yàn)組病死雞只和對(duì)照組雞只的肝臟研磨液，提取基因組作為模板用鑒定引物CAV-JD-F和CAV-JD-R進(jìn)行PCR，并將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，可見676 bp的條帶(圖1B)，表明試驗(yàn)組可鑒定到雞傳染性貧血病毒。

圖1 PCR檢測結(jié)果

2.3 CAV-XH16對(duì)雛雞組織臟器的影響 將試驗(yàn)組和對(duì)照組的5只雞在接種第8天時(shí)處死，進(jìn)行剖檢和病理組織學(xué)檢查。剖檢發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組雞只骨髓蒼白，胸腺、法氏囊萎縮，肝臟腫大。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組雞只的組織切片發(fā)生明顯改變，主要表現(xiàn)有：胸腺有出血，皮質(zhì)的淋巴細(xì)胞嚴(yán)重減少，髓質(zhì)和皮質(zhì)之間的界限縮小，胸腺中也可見大的淋巴母細(xì)胞、核巨化，網(wǎng)狀細(xì)胞空泡化、呈星狀(見封二彩版圖2A、2B)；骨髓造血干細(xì)胞極少，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞明顯減少，被脂肪組織取代(見封二彩版圖2C、2D)；法氏囊萎縮，淋巴濾泡變小且數(shù)量減少，伴隨巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(見封二彩版圖2E、2F)；肝內(nèi)可見肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的變形和腫脹，肝竇內(nèi)可見大量脂肪空泡，紅細(xì)胞減少(見封二彩版圖2G、2H)；脾內(nèi)網(wǎng)狀細(xì)胞增多，淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞減少，脾紅髓和白髓邊界不清(見封二彩版圖2I、2J)。

2.4 CAV-XH16全基因組序列測定及分析 以分離株CAV-XH16基因組為模板，分別用引物CAV-F1/CAV-R1、CAV-F2/CAV-R2和CAV-F3/CAV-R3擴(kuò)增，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到了與預(yù)期符合的842 bp、990 bp、802 bp的片段。回收各個(gè)片段后測序、拼接得到分離株CAV-XH16全基因組的序列。CAV-XH16全基因組序列已提交NCBI,登錄號(hào)為MK770259。分析CAV-XH16氨基酸序列，結(jié)果顯示，CAV-XH16 的VP1氨基酸序列含有139K和144E、75V、89T、125L、141Q、144E、394Q；VP2氨基酸序列含有95C、97C、101R、102K、86E、101R、103H、129R、131Q、150R/151K/152K、161D/162E、186E、163L和169D。VP1中第394位殘基是毒力的主要決定位點(diǎn)，394Q和394H分別代表高致病性和低致病性，CAV-XH16第394位殘基為Q，表明CAV-XH16具有高毒力特征。

2.5 CAV-XH16遺傳進(jìn)化分析 雞傳染性貧血病毒可分為5個(gè)基因型(A～E)，11個(gè)基因亞型(A1～6,D1～2和E1～3)[3]。對(duì)CAV-XH16全基因組進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明，CAV-XH16屬于A1亞群，是亞洲CAV分離株所屬的主要亞群，與中國分離株JL14023(NCBI登記號(hào)KY486145)有99.65%的相似性(圖3)。雞傳染性貧血病毒編碼的3種蛋白中，VP1表現(xiàn)出高度的多樣性。CAV-XH16的VP1與屬于同一A1亞群的VP1具有高度相似性。CAV-XH16的VP1氨基酸序列進(jìn)化分析表明，基于病毒VP1序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹與基于全基因組構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹較為相似(圖4)。CAV-XH16的VP2和VP3氨基酸序列進(jìn)化分析表明，這2種蛋白在不同的雞傳染性貧血病毒中高度相似，表明雞傳染性貧血病毒基因變異可能主要是由VP1基因變異引起的。

圖3 CAV-XH16全基因組序列遺傳進(jìn)化分析

圖4 VP1蛋白氨基酸序列遺傳進(jìn)化分析

3 討論

雞傳染性貧血病毒于1979年首次在日本分離得到，可在雞群之間傳播并引起嚴(yán)重貧血。雞傳染性貧血病毒主要有3個(gè)重疊的開放閱讀框組成，分別編碼VP1、VP2和VP3蛋白[4]。

雞傳染性貧血病毒VP1蛋白是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，C端第2、13、14、21、22位等的氨基酸變異性極高，但N端第1～19位氨基酸相對(duì)保守，富含精氨酸，可使蛋白具有高效的細(xì)胞穿透活性，從而使病毒具有更廣泛的細(xì)胞嗜性[5]。Renshaw等報(bào)道，第139～151位氨基酸是VP1蛋白的高度變異區(qū)，第139位和第144位氨基酸決定了病毒的增殖速度和傳播效力，第139位氨基酸由K變異為Q和/或第144位由E、D、N變異為Q會(huì)降低病毒對(duì)雞的感染力。CAV-XH16 的VP1蛋白第139位為K，第144位為E，表明該毒株對(duì)雞有較高的感染力。另有研究表明，如果VP1蛋白的第75、89、125、141位和第144位氨基酸同時(shí)發(fā)生變異，CAV不會(huì)導(dǎo)致貧血、白骨髓及胸腺萎縮[6]。CAV-XH16的VP1蛋白含有75V、89T、125L、141Q和144E，表明該病毒具有高毒力的特征。更重要的是，VP1蛋白的第394位氨基酸是毒力的主要遺傳決定因素，谷氨酰胺(Q)和組氨酸(H)分別代表高致病性和低致病性[7]，CAV-XH16的VP1蛋白在該處為Q，表明該病毒的VP1具有高毒力的分子特征。因此，對(duì)CAV-XH16的VP1蛋白序列分析結(jié)果表明，CAV-XH16具有VP1中所有已知的高毒力分子特征。

雞傳染性貧血病毒VP2蛋白是一種具有雙重特異性磷酸酶(DSP)活性的復(fù)制酶,可能在CAV裝配過程中作為支架蛋白，確保VP1能夠正確折疊。VP2第95、97位的半胱氨酸發(fā)生突變可顯著降低病毒增殖速率并減弱對(duì)感染細(xì)胞的致病性，因此，VP2第95、97位的半胱氨酸是CAV毒力所必需的[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道，VP2第102位的氨基酸由K變異為D，會(huì)顯著降低病毒的復(fù)制效率，第101位的氨基酸由R變異為G，會(huì)減弱病毒對(duì)細(xì)胞的致病性，但不會(huì)影響病毒的復(fù)制效率[9]。CAV-XH16的VP2第95、97、101位和第102位依次為C、C、R、K，這表明CAV-XH16對(duì)細(xì)胞具有較強(qiáng)的致病性。另有文獻(xiàn)報(bào)道，VP2中發(fā)生C86R、R101G、H103Y、R129G、Q131P、R150G、K151A、K152A、D161G、E162G和E186G等突變時(shí)會(huì)高度減弱毒株毒力，發(fā)生L163P和D169G突變會(huì)相對(duì)減弱毒株毒力[10]。CAV-XH16的VP2含有101R、103H、129R、131Q、150R、151K、152K、161D、162E、186E、163L和169D，表明CAV-XH16的VP2含有高毒力的分子特征。

雞傳染性貧血病毒VP3蛋白也被稱為凋亡蛋白，通過獨(dú)立于p53的機(jī)制，在癌細(xì)胞中特異性地誘導(dǎo)細(xì)胞周期(細(xì)胞分裂后期/分裂期)阻滯和凋亡[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道，VP3對(duì)于CAV DNA的復(fù)制和組裝是不可或缺的[12]。進(jìn)化分析表明，VP3是最保守的蛋白。VP3的保守性保證了其在CAV生命周期中穩(wěn)定的發(fā)揮功能。

本試驗(yàn)從湖北某雞場分離得到1株雞傳染性貧血病毒，并對(duì)其進(jìn)行了全基因組序列分析及VP1、VP2、VP3氨基酸序列分析。序列分析結(jié)果表明，該毒株是1株高毒力毒株。全基因組遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，該毒株屬于A1亞群，是亞洲CAV分離株所屬的主要亞群，與中國近期分離株具有高度的相似性，與中國分離株JL14023(NCBI登記號(hào)KY486145)有99.65%的相似性，CAV-XH16可作為中國最新流行株的代表，用于雞傳染性貧血病毒疫苗的研制。