關于綠色熒光蛋白發色團激發態動力學行為的實驗設計與實踐

趙 莉， 鄭海霞， 展凱云， 劉 冰

（中國石油大學（華東）理學院，山東青島266580）

0 引 言

“創新是一個民族進步的靈魂，是一個國家興旺發達的不竭動力。”因此，培養卓越的創新型人才是我國加快建設創新型國家、深入實施人才強國戰略的基礎和關鍵［1］。高等院校作為人才培養的重地，必須深化教學改革，才能適應創新型人才培養的要求［2］。綜合性創新實驗是由教師引導學生進行自主學習的一種新型教學模式，有助于培養學生的知識運用能力、創新能力和動手實踐能力，激發學生的求知欲與探索欲［3-5］。

高精度的量化計算手段結合動力學模擬的方法，是現階段研究分子激發態動力學行為有效的理論手段。它是一門結合了經典力學、量子力學、量子化學以及物理化學知識的綜合性技術。本項目依托于縱向科研項目，將最新的科研成果進行轉化，結合分子動力學以及非絕熱躍遷的研究熱點與前沿，利用高精度的量化計算手段結合面躍遷的非絕熱動力學模擬的方法，研究了綠色熒光蛋白發色團分子在獨立于熒光蛋白結構時的激發態動力學行為。通過整個實驗過程，讓學生了解科學研究的過程，增強學生的科學素養、實踐能力、創新能力、競爭能力和合作意識。

1 實驗內容設計依據

1962年，日本科學家下村修［6］從維多利亞多管水母細胞中發現了綠色熒光蛋白。1992年，Prasher等［7］將其克隆出來并投入到應用中，這給分子生物學、藥學以及細胞生物學等領域帶來了革命性的突破。它可作為一種標記蛋白無創性的植入活細胞中監測基因表達、生物分子相互作用和蛋白質定位等生物學過程［8］。而這些應用主要來自于其內部發色團高強度的熒光特性，熒光量子產率達到了0.8［9］。科學家們試圖從蛋白質中分離出發色團分子進行應用，卻發現發色團在獨立于熒光蛋白或在蛋白質失活的情況下會發生熒光淬滅現象，熒光量子產率降至10-3［10］。這種完全不同的光學行為強調了發色團與包裹在外面的蛋白質之間的聯合作用。目前已經有大量的實驗和理論研究試圖揭示發色團在溶液和氣相中的熒光淬滅機理［11-13］。在這些研究的基礎上，科學家們認為一種由激發態分子扭轉觸發的內轉換機制是導致熒光淬滅的關鍵原因［13］，分子將通過激發態與基態的錐形交叉點退回到基態。實驗中，人們發現該發色團分子的激發態壽命不隨溶液的濃度發生變化，表明分子在退激發時是一種節省空間的構型變化，也就是單鍵和雙鍵同時扭轉的過程，稱為hula扭轉［14］。然而，通過時間分辨的熒光光譜實驗卻沒有發現雙鍵扭轉的反式（trans）產物，也就是沒有cis-trans對應的雙鍵扭轉產生的異構產物。由此，他們提出發色團分子是沿著單鍵扭轉進行退激發的［15-16］。由此可見，發色團分子在退激發時到底是沿著雙鍵、單鍵還是單雙鍵同時扭轉的機制依然不明確，而這對探究如何提高單獨的發色團分子的熒光特性至關重要。因此，采用了靜態的電子結構計算結合動力學模擬的方法來研究綠色熒光蛋白發色團分子的激發態動力學行為。

2 實驗儀器

計算機、Molpro量化軟件包中的CASSCF模塊，Chemcraft及CYLview可視化軟件、自主開發的基于面跳躍的非絕熱動力學程序NAIMD-DICP、基態動力學模擬程序DFTB＋以及Origin繪圖軟件和Fortran編程軟件。

3 實驗教學設計

3.1 實驗預習

（1）實驗開始之前，教師將Molpro使用手冊、Origin繪圖軟件、Fortran編程軟件、Chemcraft及CYLview可視化軟件以及NAIMD-DICP和DFTB＋動力學模擬程序的使用說明資料發給學生，讓學生自主學習，了解量化計算軟件Molpro中CASSCF計算方法以及動力學程序的理論基礎。掌握輸入文件的構建方法，CASSCF計算中活化空間的選擇方法、線性插值法LIIC的應用和動力學模擬程序的計算流程、可視化軟件的使用、后期的數據處理如何利用Fortran自主編程以及繪圖程序Origin的使用。

（2）自主查閱文獻了解分子在激發態的幾種退激發過程，根據雅布隆斯基電子躍遷圖掌握非絕熱躍遷的理論基礎以及錐形交叉點的相關知識。

（3）教師提前準備關于綠色熒光蛋白的激發態動力學理論研究的相關文獻發給學生，讓學生提前閱讀，在此基礎上學生自主查閱相關文獻，找出研究空白，并了解文獻中的理論分析方法。

（4）學生根據閱讀自主查詢的文獻嘗試設計實驗。

3.2 實驗操作

3.2.1 模型構建

在進行模擬計算之前，構建合適的計算模型至關重要。從維多利亞多管水母細胞中分離出來的野生型綠色熒光蛋白分子是由238個氨基酸殘基組成，其晶體結構是11個β-折疊組成的桶狀結構，在桶中央有一個α-螺旋，發色團分子就在α-螺旋上，其結構如圖1所示。

考慮到綠色熒光蛋白的強熒光就來自于α-螺旋上的發色團分子，在野生綠色熒光蛋白中它是以陰離子的形式存在，因此在綜合考慮實際模型、計算效率、計算精度等因素后，選擇了一種廣泛應用的結構對羥基芐基咪唑啉酮陰離子（HBI-）作為計算模型（見圖2），該模型是把兩個甲基取代基用兩個氫原子取代，這種簡化可以保證在不改變其性質的前提下降低計算成本。這種方法已經被很多理論計算文章使用過［13，17］。HBI-是順式結構，標記為cis-1。由于重點在于研究發色團分子到底是單鍵還是雙鍵扭轉，為了區分，利用如圖2所示的二面角進行標記，單鍵扭轉為φ，雙鍵扭轉為τ。根據組合，一共可以有4種異構體，如圖3所示。

圖1 綠色熒光蛋白GFP的四級結構圖

圖2 綠色熒光蛋白發色團分子的計算模型

圖3 綠色熒光蛋白發色團分子的4種異構體

3.2.2 計算方法

實驗中發現更高能級的電子激發態對發色團分子的退激發行為影響甚微，因此在計算過程中只考慮了基態（S0）和第一電子激發態（S1）［18-19］。所有的電子結構計算都采用Molpro軟件中的CASSCF方法。CASSCF計算中有兩個具有相同比重的電子態參與態平均。值得一提的是，CASSCF的計算方法依賴于活化空間的選擇，因此選擇合適的活化空間至關重要。一般情況下，選擇的活化空間越大，計算結果越準確，但是計算耗時也越長。所以在進行靜態電子結構計算時，優先選擇大的活化空間和基組以保障計算的準確度。但是對于動態的動力學模擬過程，選擇大的活化空間和基組會消耗大量的計算機時，因此還需要在保證計算精度的前提下，選擇計算耗時更短的小活化空間。為此，對比了不同活化空間（14e，12o）、（10e，8o）以及（6e，5o）和不同基組下（6-31G*和6-31G）優化的穩定構型和錐形交叉點的結構參數，如表1、2所示。通過數據可見，（6e，5o）的活化空間搭配6-31G的基組優化得到的構型參數與大活化空間（14e，12o）和6-31G*基組得到的相差不大。另外，由于分子的激發態行為取決于該分子激發態和基態勢能面的拓撲結構，為了進一步確認（6e，5o）／6-31G計算的準確性，利用線性插值法LIIC得到了Franck-Condon點與錐形交叉點間的勢能曲線，如圖4所示。二者的拓撲結構一致，說明用（6e，5o）／6-31G進行動力學模擬得到的結果是可信的。

表1 在不同的計算水平下優化得到的HBI-分子在不同電子態的重要結構參數（鍵長單位為10-1pm，鍵角和二面角的單位為（°））

表2 在CASSCF（6e，5o）／6-31G，CASSCF（10e，8o）／6-31G*和CASSCF（14e，12o）／6-31G*計算水平下優化得到的4 個錐形交叉點的主要構型參數（鍵長單位為10-1pm，鍵角和二面角的單位為（°））

圖4 在不同計算水平下利用線性插值法得到的基態和激發態的勢能曲線

非絕熱動力學部分采用的是自主開發的基于Zhu等［20］電子躍遷理論的動力學程序，具體的計算細節需要學生在實驗預習階段掌握。軌線的核運動方程采用Velocity-Verlet［21］算法進行數值積分，步長設為0.5 fs。由于在錐形交叉點處構型變化信息更加重要，因此將步長減少至0.1 fs。每一步對應的電子態能量，梯度以及電子態耦合系數都是通過調用外接的Molpro（http：／／www.molpronet）程序包進行。在運行動力學模擬之前，需要選取合適的初始坐標和速度。初始坐標和速度的選擇方法有很多種，如基態的動力學模擬、玻爾茲曼分布、Winger分布、高斯分布等。先選擇基于DFTB＋的基態動力學模擬方法，在室溫下計算500 ps，在分子達到平衡后，再在動力學結果中隨機地選取構型和速度作為初始條件。計算的軌線數量由學生自主決定，一般數量越多，統計意義越明顯。但一般認為計算結果達到收斂即可，經過計算30條軌線可滿足要求。

4 結果與討論

4.1 靜態電子結構計算分析

靜態的電子結構計算，采用的是SA2-CASSCF（14e，12o）方法來優化基態、第一激發態的穩定結構以及兩個電子態之間的錐形交叉點。相應的結構參數已分別在表1、2中展示，錐形交叉點的構型如圖5所示。如上所述，錐形交叉點作為分子從激發態到基態的反應通道，那么優化的這4個錐形交叉點是否全部參與到退激發過程中呢？為此，還需要接下來的動力學模擬來確定上述錐形交叉點的作用。

圖5 在SA2-CASSCF（14e，12o）／6-31G*水平下優化得到的4個錐形交叉點

4.2 動力學模擬結果分析

對31條軌線進行分析，每條軌線以目標分子的弛豫過程從Franck-Condon點開始，最終生成穩定的基態產物為準。首先，統計了HBI-分子每條軌線的躍遷時間，并根據此畫出基態和激發態隨時間的布居數，如圖6所示。這些分子的退激發時間從0.3 ps持續到1.4 ps，且主要集中在0.7～1.1 ps之間。平均躍遷時間為807.3 fs，這與實驗上得到的激發態壽命吻合［22］，再一次證明了所用模擬方法是可靠的。

圖6 基態和激發態隨時間的布居曲線圖

圖7中總結了各條軌線的躍遷點與錐形交叉點之間的關系，可見，所有的躍遷點都圍繞在4個錐形交叉點周圍，說明這4個錐形交叉點都參與了發色團分子的退激發過程。值得一提的是，雖然這些躍遷點都圍繞在錐形交叉點附近，但是仍然有一定的分布范圍，表明分子在退激發時只要在錐形交叉區域內滿足躍遷條件都可以發生躍遷。另外，所有的軌線最后只產生成了順式的產物，并沒有發現反式產物。也就是說由cis-trans對應的雙鍵扭轉在整個躍遷過程中并不存在，只有單鍵扭轉產物產生。從優化得到的錐形交叉點可以看出，這4個錐形交叉點既包含單鍵扭轉的過程，也包含雙鍵的扭轉。那么，為什么最終沒有生成因雙鍵扭轉而產生的trans產物呢？為了解決這個問題，又掃描了分子在基態和激發態隨CCCN和CCCC變化的二維勢能面，如圖8所示。可以發現，分子在被躍遷至激發態后，可以有兩條路線退激發至基態，如圖8中左箭頭所示。到達基態后分子恰好落到勢能面的“山脊”上，在弛豫過程中可無勢壘的產生cis-1和cis-2。但是在生成trans產物的路徑上存在勢壘，因此阻止了trans產物的生成。

4.3 退激發機理總結

綜上所述，總結了綠色熒光蛋白發色團的退激發機理。當分子被垂直激發到第1激發態后，會通過單雙鍵協同扭轉的形式（hula扭轉）到達錐形交叉點附近，這可以解釋實驗中發現的發色團分子的激發態壽命與溶液黏度無關的現象。當分子通過錐形交叉點退激發至基態后，單鍵繼續扭轉生成新的順式結構（cis-2）或反向扭轉生成之前的反應物（cis-1）。但是此時的雙鍵只會發生反向扭轉，因此不會生成反式（trans）結構的產物，這與實驗中只發現順式產物的結果一致。

圖7 以CCCC（縱坐標）和CCCN（橫坐標）為變量做S1到S0躍遷點以及最終產物的散點圖

圖8 以CCCC和CCCN二面角為變量掃描得到的S1和S0態的勢能面［23］。上面的星標分別表示激發態和基態的最穩定構型，箭頭表示退激發反應進行的方向

4.4 實驗內容拓展

本實驗屬于研究型實驗，以野生綠色熒光蛋白的發色團分子為計算模型，采用高精度的量化計算手段以及非絕熱動力學模擬的方法進行模擬計算，綜合模擬結果進行理論分析揭示了綠色熒光蛋白發色團分子在獨立于熒光蛋白之后發生熒光淬滅的內在機理。學生在教師的指導下完成了整個模擬過程，從科研選題、量子化學基礎知識、計算模型的建立以及后期的數據分析等基本方法，激勵學生由機械式學習到自主探究型學習，培養他們交叉學科知識的綜合運用能力。考慮到課時量和不同學生的接受程度，對實驗內容進行了充實與拓展，如圖9所示。

首先是研究內容的拓展，隨著科學技術的發展以及現實需求的增加，不同顏色的熒光蛋白已經被發現或通過基因克隆與變異技術發展出來。但是，與綠色熒光蛋白不同，不同顏色的熒光蛋白具有不同的激發態行為。因此，在本工作的基礎上可以拓展以下的實驗內容：

圖9 試驗拓展內容

（1）研究藍色熒光蛋白的發色團在激發態的動力學行為，并與綠色熒光蛋白進行對比，分析不同的分子結構對激發態行為的影響。

（2）黃色熒光蛋白的激發態行為更加復雜，與藍色、綠色熒光蛋白只有第1激發態參與不同，黃色熒光蛋白的激發態行為S2態也有參與，且它的熒光量子產率與激發波長有關，因此在計算時需要考慮3個電子態之間的耦合與躍遷，鼓勵有能力的學生對現有的動力學模擬程序進行改善，使其能夠處理3個電子態的躍遷行為。

其次是研究內容的深化，目前研究的綠色熒光蛋白分子是在氣相環境中，沒有考慮液相環境的影響。因此，在本工作的基礎上，還可以考慮溶劑化效應，探索在不同溶液環境中綠色熒光蛋白發色團分子的激發態動力學行為，分析分子間氫鍵對其動力學行為的影響機制。拓展的內容工作量較大，教師可根據教學時長靈活地選取部分內容進行課堂教學，也可以作為有興趣學生的創新研究內容。

4.5 撰寫實驗報告

實驗課后，學生需要對計算模擬過程進行概括總結，分析靜態的電子結構計算與動力學模擬的結果，并按照科研論文的格式撰寫實驗報告，分析總結計算過程中所遇到的問題及處理方式。對于進行實驗內容擴展的學生研究報告，將由教師協助修改并向雜志社進行投稿。

5 結 語

本設計性實驗通過高精度的電子結構計算和非絕熱動力學模擬的手段，研究了綠色熒光蛋白發色團分子在被獨立于熒光蛋白后發生熒光淬滅的內在機理。與之前的理論報道不同，提出了綠色熒光蛋白發色團分子在退激發時是以單鍵扭轉為主，雙鍵扭轉為輔的退激發機理。

該設計性實驗包含的理論知識復雜，涉及到數學、物理、化學、計算機編程等多個學科的交叉運用，有助于培養學生的科研創新能力，知識綜合運用能力以及獨立思考解決問題的能力。到目前為止，已經取得了很好的成績，有6位本科生通過查閱文獻，自己擬定題目并獲批校級大學生創新項目，有4位已在雜志上公開發表科研論文。對于想繼續讀研究生的學生，可大大縮短他們融入科研團隊的周期。