牦牛卵丘細胞體外培養方法優化

李晶晶潘陽陽馬睿韓小紅張翠蘭余四九*

（1，甘肅農業大學動物醫學院甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心 730070；2，甘肅省永登縣疫病預防控制中心 730300）

家畜的繁殖性狀是其重要的經濟性狀，卵巢是雌性動物生殖的基礎，卵泡是卵巢的基本功能單位，是卵子發生的微環境，當卵泡發育至有腔卵泡期卵丘細胞 （Cumulus cells，CCs）通過高度特異性的細胞質突起穿過透明帶接近卵母細胞膜形成縫隙連接和細胞間橋等連接功能上的合胞體即卵丘卵母細胞復合體 （cumulus-oocyte complexs，COCs）[1]， CCs在卵母細胞周圍特殊的結構組織有利于它們之間的持續相互作用。事實上，CCs為卵母細胞提供營養[2]如小分子物質丙酮酸、氨基酸、核糖核苷等；支持卵母細胞胞質成熟[3]，CCs維持卵母細胞減數分裂停滯[4]。因此，CCs可以用研究卵母細胞成熟機制研究；CCs也可作為核移植良好的供體細胞[5]；也可用于探討某些因子或藥物對卵巢的作用機制[6]。本研究以牦牛的卵巢為材料，采集其卵泡中的COCs，進行CCs分離原代改良培養，并對所得到的細胞進行傳代培養，以改良牦牛CCs的體外培養方法，為牦牛的卵母細胞成熟、CCs生物學等方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牦牛卵巢取自西寧屠宰場。DMEM/F-12、胎牛血清 （Fetal Bovine Serum，FBS）購于Gibco公司；胰蛋白酶、透明質酸酶和DMSO等購自Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 牦牛卵丘細胞原代改良培養

將牦牛卵巢放在加有抗生素、溫度在35～37℃生理鹽水的保溫瓶中，并于4h內帶回實驗室。使用12號針頭的10ml注射器從直徑2～6 mm的卵泡中回收COCs[7]。在體視顯微鏡下收集胞漿均一和至少3層完整致密的卵丘細胞COCs，進行CCs的分離培養。隨后，用0.1%透明質酸酶消化COCs，直到CCs與卵母細胞完全分離。體視顯微鏡下去除裸卵。CCs在1000r/min離心5min后，用磷酸鹽緩沖液 （PBS）洗滌2次，調節細胞濃度為1×105/ml，原代細胞在含有15%和10%FBS的DMEM/F12培養基的細胞培養液中37℃，5%CO2培養。根據培養液顏色橘紅色生長良好，黃色則需要換液，一般原代前期每兩天換液一次，對數期開始每隔一天換液一次。

1.2.2 傳代培養

原代細胞匯合至90%時棄去培養液，先加入PBS約2～3ml，輕輕晃動培養瓶，漂洗1～2次，用移液槍吸干PBS后加入胰蛋白酶消化液1ml，輕輕晃動培養皿使消化液沒過整個細胞層，顯微鏡下觀察，發現胞質回縮，細胞間隙增大，應立即吸棄消化液再根據細胞脫落情況選擇適當干消化，當大片細胞開始脫落時迅速加入2ml完全培養液終止消化。將消化后的細胞混合液轉移到離心管中，1000r/min離心3min，棄上清，再用PBS離心清洗2次，棄上清液在沉淀中加入完全培養液，調節細胞濃度為1×105/ml，細胞在10%FBS和1%青霉素/硫酸鏈霉素溶的含DMEM/F12培養基的細胞培養液中培養，37℃，5%CO2。待細胞生長匯合至90%左右進行傳代或凍存。

1.2.3 牦牛卵丘細胞生長曲線

當兩種原代培養的原代CCs匯合至90%時，分別用胰蛋白酶消化，密度為1×105的細胞懸液接種于24孔板0.5mL/孔37℃，5%CO2培養，接種細胞密度為第一天的細胞密度，之后每天在同一時間從24孔板用胰蛋白酶消化三孔細胞，用細胞計數板計數后計算出細胞密度，三孔求平均值為當天細胞密度。以培養天數 （d）為橫坐標，以當天細胞密度 （×105個/ml）為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3 數據分析

所有驗驗至少重復3次，并使用SPSS對數據進行單因素方差分析實驗數據。

2 結果

2.1 牦牛的卵丘細胞原代培養與傳代

牦牛的CCs采用貼壁法進行培養。15%FBS培養的原代CCs（1×105個/ml）在接種到培養瓶或平皿中6～8h就有貼壁，12h后觀察到有少量細胞已經貼壁生長，由圓形變成長梭形或不規則三角形，呈放射狀排列。3d時大部分貼壁細胞末端相互接觸，開始匯合，細胞形成叢生狀，細胞之間有大片間隙。4～5d時細胞之間空隙減少，相連成片，并排列成有序的束狀或帶狀。7～8d后細胞之間空隙消失，細胞排列緊密飽滿而有規則，鋪滿培養瓶的底部 （見圖1a）。15%FBS培養的原代細胞匯合成90%，即可進行傳代 （1×105個/ml），細胞生長有規律，形態穩定多為梭形 （見圖1b），培養過程中可視培養液的顏色1～3d換一次培養液。以上述方法傳代可連續傳至15代以上細胞形態穩定且不老化。而10%FBS培養的原代細胞形態形成細胞單層需要9～10d，細胞形態不穩定，出現不同生長區域，相對平鋪不飽滿 （見圖1c），傳代培養后細胞形態不均一 （見圖1d）相同條件培養傳至第7～8代開始老化。

2.2 牦牛卵丘細胞二代生長曲線

牦牛CCs生長曲線基本上呈 “S”型 （見圖2～3）。15%FBS接種后，細胞經歷2d的緩慢生長的潛伏期，第3天細胞開始迅速生長， 進入對數生長期， 到第7天細胞開始發生接觸抑制，之后細胞生長緩慢， 進入平臺期 （見圖2）。10%FBS接種后，細胞經歷3d的緩慢生長的潛伏期，第4天細胞開始進入對數生長期， 到第8天細胞開始發生接觸抑制進入平臺期 （見圖 3）。

3 討論

牦牛原代卵丘細胞 （1×105個/ml）接種后，隨著貼壁生長形狀由圓形變成長梭形或不規則三角形，呈放射狀排列而不是長梭形或流線型，這與豬、牛的原代卵丘細胞形態一致[8，9]。但15%FBS培養細胞排列緊密飽滿而有規則，鋪滿培養瓶的底部，可傳至15代以上。10%FBS培養細胞相對平鋪不飽滿，成簇生長，傳至7～8代就開始老化。相同培養條件觀察二代培養細胞生長曲線可以看出，原代10%FBS培養的二代第4天進入對數生長期，對數期相對平緩，第7天進入平臺期。而原代15%FBS第3天就進入對數期，對數期相對陡峭細胞活性較高，第7天進入平臺期。這與牛顆粒細胞等生長曲線相似[9]，比豬卵丘細胞[8]進入平臺期少1d，這可能與物種有關。另外要獲得優質培養細胞還要注重細胞培養操作細節，在傳代培養時注意把握消化時間，先濕消化再干消化可最大程度減少消化液對細胞的傷害，適時更換培養液，減少機械化學損傷和污染發生，最大限度保證良好的培養條件，來獲得形態良好活性較高的卵丘細胞。

結果表明不同的原代培養條件可影響傳代細胞生長規律和質量，牦牛卵丘細胞原代培養改良后，第二代細胞生長曲線“S”型，接種后，經歷2d的潛伏期，第3d細胞開始迅速生長，進入對數生長期，細胞形態良好，到第7d細胞開始發生接觸抑制，進入生長緩慢的平臺期；細胞可傳至15代以上不老化，可用于建立牦牛卵丘細胞株。穩定生長形態良好的牦牛卵丘細胞可用于牦牛卵丘細胞生物學研究，為牦牛卵母細胞成熟機制研究奠定基礎。