干涉顯微細胞相位快速恢復及圖像預處理分析

鐘彩 潘梅森 彭春富 胡常樂

摘? ?要：和傳統成像技術相比較，相位顯微成像應用期間省略了染色環節，并且能實現無損傷性操作，成像結果可以數量化，近年來在生物細胞學科領域中有較廣泛應用。很多學者陸續提出較先進的定量相位成像技術和光波干涉原理存在一定相關性。文章首先闡述了相移干涉顯微成像基本原理及典型的相位恢復方法;其次提出新型微分相位提取法;最后對顯微鏡下細胞圖像進行預處理，并以此方法作出模擬及實驗驗證，目的是闡述相位梯度用于辨識細胞類別及內部結構的可行性。

關鍵詞：干涉顯微細胞;相位快速恢復;成像技術;圖像處理

顯微技術是研究細胞內部結構與動力學行為的主要手段，過往生命科學研究中長期沿用傳統顯微鏡，適用性偏低的問題逐漸暴露出來，成像技術及方法噬待作出創新。Zernike在20世紀40年代初期首次提出相位成像技術的概念，成功把樣品位相結構轉型為光結構改變，明顯提升了相位物體的可辨識度[1]。伴隨研究深度的拓展，更多人員認識到定位測量相位分布情況的必要性。

1? ? 相移干涉顯微成像

1.1? 相移干涉原理

針對干涉顯微的運行機制，可以從光波干涉和顯微拓展兩個方面予以分析。通過收集明暗相間的干涉圖像，在適宜算法的支撐下處理干涉圖像，獲取和被測物體相位信息相關的資料，實現相位目標。當下可供選擇的干涉相位相位技術并不唯一，其中，平面光波在兩相干涉光波中應用較為廣泛。

相移干涉被定義為由差異性的相移量引入至物光臂或參考臂，為采獲相應對相移干涉圖形創造便利，然后基于被采獲圖樣，有效分離其內儲中待測物體的相位排布狀況。過往的相移干涉一般會把不同的常數相移按照一定次序引入至參考光，進而獲得存在多種改變的干渉圖樣。可假定在記錄平面上參考光的復振幅是[2]：

（1）

在式（1）中，n代表晌數序列，δn代表第n幀的相移量，綜合分析后，可用式（2）表示經物光波與參考光波相干涉后的強度：

（2）

式（2）是相移干涉的基本表達式。

1.2? 相移干涉下的典型相位恢復方法

（1）最小二乘法：是相移干涉內重現相位信息的常用方法之一，能較為便利地測得干涉圖樣內的一些未知參數，并確保求得的參數數值和真實值之間誤差平方和最小。

（2）代數運算解析法：在相移干涉中，通常要求采獲的干涉圖樣數目不低于3個，才可以從根本上保證相位信息的重現效果。對以上操作決策進行分析可知，主要由于在相移已知時，其干涉強度涉及了3個未知數，即：I0（x， y），γ（x， y）與φ（x， y），三步與四步相移干涉應用范圍較廣。

（3）主分量分析方法：屬于數學學科領域中的一種降維統計方法，利用一個正交變換把一個已知有關變量轉型為不相關的變量。

2? ? 新型微分相位恢復方法

2.1? 基本理念

傳統微分相位恢復法能在離軸式干涉顯微內快捷、高效地提取定量相位信息，得力于在定量成像系統內調整條紋周期短于成像系統的衍射極限，可以不計入樣品臨近區中誘導的相位改變，即有<

針對以上情況，本文提出了一種新型相位恢復法，與某種條件之間持有較高的契合度，在整體、輕微離軸干涉領域中均表現出較高適用性，具體使用時只需要測算出干涉圖樣的干涉項、一階及二階偏導便能達到相位恢復。

2.2? 模擬微小球數值及驗證方法

為強化計算的簡潔性，設物光波與參考光波都是單位振幅的平面波。光源波長設為632.8 nm，載波傾斜角是0.025 rad，該小球相位恢復的全過程如圖1所示，其中，圖1（a）是模擬的小球干涉，規格是512×512像素，觀察本土能發現一個圓形區，域該圓形輪廓相對應的為小球沿軸向形成的投影。該區中干涉條紋存有較顯著的彎曲，囊括了小球振幅與相位信息[3]。圖1（b）是經高通濾波處理后所分離出的干涉項。圖1（c）和圖1（b）依次是干涉圖的橫向一、二階偏導圖樣，依照主分量分析方法，能較快速獲得小球的相位分布，如圖1（e）所示。本文使用的小球是均質體，相位和軸向厚度兩者存在線性關系，故而能直接由相位分布內解耦厚度，如圖1（f）所示。歷經系統測算后，模擬計算出的最大厚度值是4.007 1 μm，和理論值相比較偏差0.007 1。由此推測出以上方法應用期間持有較高準確度。

2.3? 相位梯度形態估算法

用數字圖像處理內邊界檢測的思維去設定細胞的邊緣，進而大致估算細胞的規格及形態。相位梯度對細胞邊緣及折射率改變表現出較高的敏感性，早已被相關學者所論證。對白細胞相位圖行橫向一階偏導運算，獲得的結果如圖2所示。從宏觀層面上分析，圖2（a—b）呈現出的分別是一個同心球、偏心球模型，圖2（c）為一個外球內含有兩個大小等同的偏心球模型[4]。能較好地呈現出細胞及細胞核的大小及空間方位，以上也和本研究所構建的理論模型相匹配。故而，相位梯度能為解讀細胞內部結構與形態相關工作提供較合理的參考，但需闡述的是，不可以只是從單一方向的相位梯度就百分百確定細胞的形態等參數，主要是因為相位呈現的為生物細胞核周邊環境相對折射率差以及細胞厚度兩者乘積，而無法清晰呈現出各點對應的具體情況。

3? ? 實驗研究

3.1? 基于完全離軸干涉的均質紅細胞

觀察基于衍射相位顯微采到的紅細胞干涉圖像可發現，背景橫直條紋密集化，條紋對應的載波頻率也相對較大，如圖3（a）所示。橫直條紋處于水平向，因而可推測平面參考光于y向發生傾斜，此時采用新型微分法運算時，需計算圖樣在y向上的一階和二階偏導。圖3呈現了紅細胞相位恢復的預算全過程。對比圖3（f）與圖3（g），發現兩者在分布上有一定相似之處，圖3（f）內的噪聲較大，但該因素并不會影響整個輪廓，對其成因予以分析，主要由于采用的干涉圖絕非是試驗期間獲得初始圖像。對該試驗結果整體分析后，認為該方法用于實踐中在準確性、可執行性方面占據優勢[5]。

3.2? 基于微離軸干涉的皮膚癌細胞

微離軸干涉可以被看成是一種介于同軸干與離軸干涉之間的一類干涉模式。通常情況下，在微離軸干涉中，需要采獲的相移干涉圖為兩幅，其目的是解除背景光強，隨即采用希爾伯特轉化兩個干涉圖樣的差，實現恢復整個相位。圖4是微離軸干涉成像系統采集到的一副干涉圖，采用本文所建設的新型相位恢復法提取圖4癌細胞持有的相位信息。以精確處理圖像的思想為支撐，消除背景光強干擾后，能較順利、精確的獲取到干涉項，而后測算干涉圖樣于y向的一、二階偏導，建所需的相位分布，如圖4（b）所示。圖4（c）是基于二步相移干涉下經轉化而獲得的相位結果。比較圖4（b—c）兩個相位分布狀況，發現兩者之間并沒有顯著差異，結合Shaked在研究中論述的內容，充分地證實該新型微積分用于細胞成像領域中的精確性、穩靠性[6]。

4? ? 結語

Bhaduri提出的傳統微分相位恢復法在使用期間，僅會涉及微分運算，具有運算快速的優勢，但對相位變化情況提出較嚴格的要求。為了提高顯微鏡下細胞圖像研究效果，基于傳統方法的相位余數，本文提出了一種新型微分相位恢復法，實驗研究表明，該方法不僅在離軸干涉領域中表現出較高的適用性，還適合微離軸干涉，在生物細胞類別辨識領域也有較大的推廣價值。經過預處理后，能得到更清晰的細胞圖像，有利于后續圖像的定位分割研究。

[參考文獻]

[1]司訪，曹娜，呂登飛.人與四種實驗動物血液圖像分析方法綜述[J].赤峰學院學報（自然科學版），2018（7）：104-105.

[2]張靜，蔣莉，張麗芬，等.熒光成像技術自動檢測線索細胞的研究[J].廣東醫科大學學報，2018（3）：256-259.

[3]程鴻，呂倩倩，韋穗，等.基于光強傳輸方程與SLM的快速相位恢復（英文）[J].紅外與激光工程，2018（7）：297-301.

[4]董健，許志強，孫云霞，等.基于多波束相位恢復的射電望遠鏡主反射面動態形變的快速測量[J].光學學報，2018（6）：198-205.

[5]李聰慧，曹若凡，許夏瑜，等.無透鏡顯微成像技術在即時檢測中的應用進展[J].中國激光，2018（2）：224-233.

[6]孔文，高峰，樊金宇，等.線掃描共聚焦成像技術在生物醫學成像中的應用[J].激光與光電子學進展，2018（5）：18-26.

Rapid phase recovery and image retention analysis of microcells

Zhong Cai， Pan Meisen， Peng Chunfu， Hu Changle

（Changde? Vocational? Technical? College， Changde 415000， China）

Abstract：Compared with the traditional imaging technology， the staining link is omitted during the application of phase microscopic imaging， and the damage-free operation can be realized， and the imaging results can be quantified， which has been widely used in the field of biological cell science in recent years. Many scholars have put forward more advanced quantitative phase imaging technology， many of which have some correlation with the principle of light wave interference. Firstly， the basic principle and typical phase recovery method of phase-shifting interference microscopy are introduced in this paper. Secondly， a new differential phase extraction method is proposed. Finally， it preprocesses the cell image under the microscope， and uses this method to make simulation and experimental verification. The feasibility of using phase gradients to identify cell types and internal structures is described.

Key words：intervention microcells; rapid phase recovery; imaging technology; image processing