砷暴露的體外及體內微核試驗研究

鄭艷艷，謝晶，甘永金，梁丹玉，李羨筠

廣西壯族自治區職業病防治研究院中毒與毒理研究所，廣西 南寧 530021

20世紀90年代開始，用微核技術檢測化學致癌物對細胞的遺傳損傷研究得到了發展[1-2]。已有大量數據表明，砷可導致腫瘤的發生[3-5]。為了進一步了解砷的遺傳損傷作用，本研究采用體外胞質分裂阻滯法微核試驗及體內外周血嗜多染紅細胞微核試驗觀察不同劑量砷暴露引起的微核率改變。

1 材料與方法

1.1 體外實驗

1.1.1 材料 正常人肝素鈉抗凝外周血；RPMI1640培養基(中國協和醫科大學基礎醫學院提供)；亞砷酸鈉(NaAsO2，廣州化學試劑廠)；細胞松弛素B(CytoB，Sigma)；甲醇、冰醋酸為國產分析純。

1.1.2 試驗方法 在4.5 mL RPMI1640培養基中取加入正常人抗凝血0.4 mL及0.1 mL不同濃度的NaAsO2溶液(砷終濃度為0 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、400 μg/L)，置37℃培養至72 h 收獲細胞(44 h 時加入終濃度為6 μg/mL 細胞松弛素B)，用常規方法制片，Giemsa染色后封片保存。在油鏡下計數結構完整、著色清晰的雙核淋巴細胞微核數。

1.2 體內實驗

1.2.1 材料 實驗動物為體質量25～30 g 的無特定病原體動物(SPF)級ICR 雄性小鼠40 只，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[許可證號：SCXK(湘)2016-0002]。本實驗室取得廣西壯族自治區科技廳頒發的《實驗動物使用許可證》，許可證號：SYXK桂2016-0005。

1.2.2 試驗方法 將ICR 雄性小鼠40 只應用完全隨機化的方法分為陰性對照組、10 mg/(kg·bw)組、20 mg/(kg·bw)組、30 mg/(kg·bw)組，每組10 只，亞砷酸鈉按劑量要求經口灌胃染毒，隔天染毒1次，共染毒3次，陰性對照組給予生理鹽水。末次染毒后第3天從動物尾靜脈采集外周血用血涂片法直接涂片，空氣干燥后放入甲醇固定10 min，Giemsa染色后在油鏡下觀察嗜多染紅細胞的微核。

1.3 統計學方法 利用SPSS13.0 統計軟件進行統計學處理，計數資料進行χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度NaAsO2對體外淋巴細胞微核的影響 由表1 可見，體外胞質分裂阻滯法微核試驗中雙核淋巴細胞在砷終濃度為200 μg/L、400 μg/L 時的微核率高于0 μg/L，差異均有統計學意義(χ2=125.856，P＜0.05)。雙核淋巴細胞的微核率隨含砷濃度增加，微核率呈線性增多。圖1 為含有1 個微核的雙核淋巴細胞。

表1 不同濃度NaAsO2的體外淋巴細胞微核試驗結果

圖1 含微核的雙核淋巴細胞(×100)

2.2 不同濃度NaAsO2對體內微核的影響 體內試驗經口給予亞砷酸鈉后，20 mg/(kg·bw)、30 mg/(kg·bw)劑量組受試動物出現活動減少、嗜睡等中毒癥狀，出現個別動物死亡。由表2可見，體內微核試驗外周血嗜多染紅細胞微核率30 mg/(kg·bw)劑量組明顯高于陰性對照組，差異有統計學意義(χ2=13.930，P＜0.05)，并呈劑量-反應關系。圖2為油鏡下觀察的外周血嗜多染紅細胞，箭頭所指的是含有微核的嗜多染紅細胞。

表2 不同濃度NaAsO2的體內微核試驗結果

圖2 油鏡下外周血嗜多染紅細胞(箭頭所指為有微核的嗜多染紅細胞，×100)

3 討論

微核是由具有遺傳損傷的物質作用于細胞后導致染色體斷裂或整條染色體丟失形成的。微核試驗是國際上公認用于篩選遺傳損傷物質的毒理學試驗，可分為體內試驗和體外試驗。

體外淋巴細胞微核試驗是將受試物暴露于淋巴細胞，37℃培養，加入植物血凝素促其分裂增殖，利用細胞松弛素B 抑制細胞胞質分裂但不影響細胞核分裂，再觀察雙核淋巴細胞微核率，反映出受試物在染色體水平上所受到的遺傳損傷。體內微核試驗是通過適當染毒方法給予受試物后，觀察動物外周血嗜多染紅細胞微核發生率，以評價受試物發生突變的可能性。在紅細胞系祖細胞分裂期如有遺傳損傷的物質作用會導致中期染色體分裂異常形成微核，有核紅細胞發生脫核形成無核的紅細胞過程中胞漿中的微核并不能通過脫核排出，殘留于紅細胞細胞質中，形成攜帶微核的嗜多染紅細胞[6]。由于嗜多染紅細胞胞質內含有核糖體，成熟紅細胞核糖體已消失，可通過選擇性的染色即Giemsa 染色將嗜多染紅細胞染成灰藍色，而成熟紅細胞染成淡橘紅色，通過顯微鏡下觀察細胞顏色的不同將兩種細胞區別開來。

隨著經濟的不斷發展，砷化物的開采、冶煉等不斷增加，砷雖是個古老的毒物，但砷對人類健康造成的危害不容忽視。砷可阻止細胞呼吸，導致細胞代謝發生障礙，對多種酶有抑制作用，流行病學資料顯示，砷暴露人群可導致DNA 損傷等明顯的細胞遺傳毒性[7-11]。長期暴露砷可導致自然流產、試產、早產發生率及低出生體重危險度顯著升高，長期吸入高濃度大于100 ng/m3砷死產OR 值高達8.4[12]。國際癌癥研究機構將無機砷確認為人類致癌物，但砷致癌流行病研究和動物試驗結果并不完全相同。為減少人群混雜因素的影響，本研究在實驗室單一條件下分別進行體內和體外微核試驗，體外試驗用胞質分裂阻滯法微核試驗研究砷暴露引起的淋巴細胞遺傳損傷，試驗結果表明砷終濃度為200 μg/L、400 μg/L 的條件下，淋巴細胞雙核微核率明顯增加。在試驗過程中發現高濃度砷暴露可導致淋巴細胞轉化率下降，細胞死亡現象明顯，雙核淋巴細胞容易觀察到多個微核出現，且容易觀察到核質橋和核芽，核質橋和核芽是近期發現的早期染色體損傷的生物學標志，核質橋是基因錯誤修復的標志，而核芽是基因擴增的標志[13]。試驗中高濃度砷暴露出現的核質橋和核芽的改變將成為下一步研究的重點。體外微核試驗的優點是直接或間接誘導DNA損傷，判斷有無誘發染色體異常的毒理效應，但體外試驗是一種非正常生理條件下的實驗，因此在實驗設計時增加了體內微核試驗。體內微核試驗以ICR 雄性小鼠為研究對象，實驗動物經口灌胃給予亞砷酸鈉后，通過觀察動物外周血嗜多染紅細胞微核率的發生情況，判斷砷暴露引起的遺傳損傷，體內試驗結果表明，嗜多染紅細胞微核隨著染毒劑量的增加而增加，呈劑量-反應關系。本次通過體內體外兩種方式分別研究砷暴露的遺傳損傷，其結果均提示砷可導致遺傳損傷。