胃癌組織中Septin9 和Cyclin D1 的表達(dá)及臨床意義

江威，章禮久

（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥）

0 引言

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，我國是胃癌的高發(fā)國家之一，據(jù)2015 年中國癌癥數(shù)據(jù)報(bào)告顯示，胃癌發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中均高居第二位[1]，嚴(yán)重危害了人民群眾的健康。研究表明，進(jìn)展期胃癌患者即使接受外科手術(shù)等綜合治療，5 年生存率仍不足30%[2]。因此，積極探索胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋求新的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)對(duì)于胃癌的診治和預(yù)后具有重要的臨床意義。SEPT 基因家族是一類具有GTPase 活性的保守基因家族，廣泛分布在除植物外的幾乎所有真核生物中。參與細(xì)胞極性、細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期調(diào)控及凋亡等重要生理過程，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)[3]。研究表明Septin9 在結(jié)直腸癌[4,5]、血液系統(tǒng)腫瘤[6]、乳腺癌[7]等多種腫瘤中高表達(dá)，其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力。細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是G1 期的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞由G 期進(jìn)入S 期。Cyclin D1 已被公認(rèn)是一種原癌基因，其過表達(dá)可引起細(xì)胞增殖失控，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[8]。以上提示，Septin9 和Cyclin D1 均在腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控以及發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。本研究通過檢測(cè)Septin9 和Cyclin D1 在胃癌組織中的表達(dá)情況，初步探討其臨床意義，旨在為胃癌的生物學(xué)行為提供新的參考指標(biāo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018 年2 月至2019 年6 月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的胃癌標(biāo)本60 例。均經(jīng)過術(shù)后病理證實(shí)，病理診斷均經(jīng)兩名醫(yī)師確認(rèn)，患者具備完整的臨床及病理學(xué)資料。其中男性41 例，女性19 例；年齡35～79 歲，平均年齡62.7±9.5 歲。腫瘤直徑≤5 cm 18 例，＞5 cm 42 例。腫瘤位于賁門/胃底26 例，胃體15 例，胃竇19 例。術(shù)后病理均為腺癌，其中低分化37 例，中分化14 例，高分化9 例；根據(jù)TNM 分期，其中TNM I 期7 例，TNM II 期14 例，TNM III 期18 例，TNM IV 期21 例；浸潤深度：T1 期 7 例，T2 期10 例，T3 期16 例，T4 期27 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36 例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移者24 例。另外，選取對(duì)應(yīng)的60 例距離腫瘤組織邊緣＞5cm 的癌旁正常組織作為對(duì)照組。所有患者在術(shù)前均未接受化療、放療或其他輔助治療。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑

兔抗Septin9 多克隆抗體購自Affinity 公司；兔抗Cyclin D1多克隆抗體購自Affinity 公司；鼠抗β-actin 抗體購自北京中杉金橋有限公司；山羊抗小鼠IgG 購自北京中杉金橋有限公司；山羊抗兔IgG 購自Affinity 公司。

1.2.2 Western blot 實(shí)驗(yàn)

新鮮胃癌和癌旁組織，剪碎，加入蛋白裂解液，進(jìn)行研磨，4℃，13200rpm 離心20 分鐘，提取總蛋白。根據(jù)BCA 試劑盒的步驟繪制蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的濃度值。SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5% 脫脂奶粉封閉，一抗4℃冰箱過夜，TBST 洗膜，10 min/ 次，共3 次，二抗室溫孵育60min，洗膜3 次后滴加ECL 發(fā)光液，曝光顯影，觀察結(jié)果。采用Image J 軟件分析不同條帶的灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。定量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)采用t 檢驗(yàn)比較，采用Pearson 相關(guān)性分析法分析相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Septin9 與Cyclin D1 在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

60 例胃癌組織中Septin9 蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.754±0.179），高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織表達(dá)水平 (0.101±0.020)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖1）。不同臨床分期的胃癌組織中，Septin9 蛋白表達(dá)隨著臨床分期增加而遞增，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義（P＜0.01）（見圖2）。Cyclin D1 在胃癌組織 中的相對(duì)表達(dá)量為（1.217±0.245），高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織表達(dá)水平（0.132±0.038），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖3）。不同臨床分期的胃癌組織中，Cyclin D1 蛋白表達(dá)亦隨臨床分期增加而遞增，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖4）。

圖2 Septin9 在不同臨床分期中的表達(dá)情況。(A) western blot 法檢測(cè) Septin9 在不同臨床分期胃癌組織中的表達(dá)情況。（B）Septin9 蛋白表達(dá)的Image J 灰度分析結(jié)果。＊＊P＜0.01 與I 期比較，##P＜0.01 與II 期比較。

圖3 Cyclin D1 在胃癌組織中的表達(dá)。（A）western blot 法檢測(cè)Cyclin D1 在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)情況。（B）Cyclin D1 蛋白表達(dá)的Image J 灰度分析結(jié)果,＊＊P＜0.01 與癌旁比較。

圖4 Cyclin D1 在不同臨床分期中的表達(dá)情況。(A) western blot 法檢測(cè)Cyclin D1 在不同臨床分期胃癌組織中的表達(dá)情況；（B）Cyclin D1蛋白表達(dá)的Image J 灰度分析結(jié)果。＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 與I 期比較，##P＜0.01 與II 期比較，△△P＜0.01 與III 期比較。

2.2 胃癌組織中Septin9、Cyclin D1 表達(dá)分別與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Septin9 表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、發(fā)生部位無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，與胃癌分化程度、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)（P＜0.05）。Cyclin D1 表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、發(fā)生部位、浸潤深度無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，與胃癌分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期密切相關(guān)（P＜0.05），詳見表1。

2.3 胃癌組織中Septin9 和Cyclin D1 表達(dá)的相關(guān)性

在胃癌組織中，Septin9 和Cyclin D1 表達(dá)呈正相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖5。

3 討論

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，受多種癌基因、抑癌基因和環(huán)境因素的調(diào)控。其基本的生物學(xué)特征是腫瘤細(xì)胞的失控性增殖和凋亡的減少。精確的細(xì)胞分裂對(duì)于多細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要，細(xì)胞周期紊亂、細(xì)胞增殖失控促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。故探討與惡性腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的基因或蛋白，對(duì)于腫瘤的診治和預(yù)后具有重要意義。

表1 Septin9、Cyclin D1 表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

圖5 散點(diǎn)圖示在胃癌組織中Septin9 和Cyclin D1 的表達(dá)具有相關(guān)性，P＜0.01。

SEPT9 是SEPT 基因家族中的一員，位于人類染色體 17q25.3，有18 種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[10]。基因芯片分析表明SEPT9 在多種人類腫瘤中持續(xù)表達(dá)[11]，包括乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、肝臟和卵巢等。Connolly D 等[12]發(fā)現(xiàn)，SEPT9 基因的4 個(gè)變異型v1、v3、v6 和v7 在乳腺癌組織中均高表達(dá)。Montagna 等[13]在SEPT9過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了Thsp1 和Bax 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡下調(diào)，并可以通過抑制SEPT9 的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，Septin9 在胃癌組織中高表達(dá)，與癌旁組織比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與李楠[14]報(bào)道的結(jié)果一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Septin9 的表達(dá)隨著臨床分期的增加而遞增，且與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期均有關(guān)，表明Septin9 的表達(dá)與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1) 基因是一種重要的原癌基因。CyclinD1 編碼的蛋白與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6 結(jié)合，觸發(fā)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞由G1 期進(jìn)入S 期。Cyclin D1 過表達(dá)可引起細(xì)胞增殖失控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[8]。Cyclin D1 基因在大部分人類腫瘤中如胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸部鱗癌和結(jié)直腸癌等過表達(dá)或擴(kuò)增[15]。本研究顯示，Cyclin D1 在胃癌組織中高表達(dá)，且相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，與在其他腫瘤中的結(jié)果一致，并且Cyclin D1 的表達(dá)隨臨床分期增加而遞增，與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期密切相關(guān)。此外，本研究相關(guān)性分析顯示，胃癌中SEPT9 過表達(dá)與Cyclin D1 高表達(dá)呈正相關(guān)。提示Cyclin D1 高表達(dá)可能參與了SEPT9 介導(dǎo)的胃癌進(jìn)展的過程。Gonzalez 等[16]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中SEPT9_v1 表達(dá)上調(diào),通過延遲c-Jun-N-末端激酶(JNK)的降解，穩(wěn)定JNK1、JNK2 激酶的表達(dá)水平，從而增加JNK / c-Jun轉(zhuǎn)錄活性，引起下游的Cyclin D1 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，Septin9 和Cyclin D1 在胃癌組織中高表達(dá)，兩者均與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期有關(guān)，且Septin9 與Cyclin D1 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。進(jìn)一步的研究分析對(duì)于胃癌的診斷和治療具有一定的臨床意義。