基于GC-TOF-MS代謝組學研究栝樓桂枝湯對腦缺血大鼠的作用機制

郭雙，戴成球，金欽，張玉琴，許文*，黃鳴清*，林羽，徐偉

(1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學生物醫藥研發中心，福建 福州 350122)

腦卒中又稱中風，發病迅速，癥狀多樣，致殘率高，死亡率高，近年已成為導致死亡的主要原因，嚴重威脅著人類的生命[1]。其中缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，是由于血管堵塞導致的大腦血流急劇減少甚至供應中斷，繼而引發局部腦組織壞死，腦卒中在我國仍然是第一大致死性疾病[2]。

栝樓桂枝湯來源于張仲景的《金匱要略》，由天花粉、桂枝、白芍、甘草、生姜、大棗六味藥組成，具有祛風和營，生津柔筋之功用。陳立典教授結合多年的臨床經驗將栝樓桂枝湯應用于腦卒中后的康復取得良好的療效，目前該方顆粒劑經申報批準為福建省第二人民醫院院內制劑(批件號：閩 2013S0001)[3-4]。前期課題組開展了該方對海馬神經細胞及中腦動脈閉塞(MCAO)模型大鼠的作用[5]，發現栝樓桂枝湯對缺血性腦卒中大鼠及原代海馬神經元有一定的保護作用，其保護作用與其抗細胞凋亡作用有關。

代謝組學是系統生物學的重要組成部分，主要指特定時期內由細胞、組織或生物體產生的所有小分子量代謝物總和[6]，它采用了系統生物學的策略和方法，基于疾病和藥物干預下的系統代謝網絡的整體性和動態性的變化，評價中藥復方的整體效應及調控機制。本實驗在前期課題組對于栝樓桂枝湯血清藥物化學分析[7]及對腦缺血再灌注損傷的治療作用的研究基礎上，首次采用氣相色譜-高分辨率飛行時間質譜聯用(GC-TOF-MS)的大鼠血清代謝組學方法，通過分析栝樓桂枝湯對MCAO大鼠的內源性化合物水平的影響，找出潛在的小分子生物標志物，并建立栝樓桂枝湯治療缺血性腦卒中代謝途徑分析方法，為其對機體的整體作用效應和分子調控機制提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物及飼養環境 健康成年雄性SD大鼠30只，SPF級，體質量260～300 g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物合格證號：2007000509960，許可證號：SC-SCXK (滬)2012-0002。實驗動物飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室，溫度為22～24 ℃，相對濕度50%～70%；標準飼料及滅菌潔凈水；自由攝食飲水；每天定時更換墊料，保持干燥；光/暗周期12/12 h；醫學實驗動物環境設施許可證號：SYXK (閩)2014-0005。

1.2 藥品與試劑 栝樓桂枝湯(院內制劑，顆粒劑)；內標：L-2-氯苯丙氨酸(批號:103616-89-3，≥98%)，購自上海恒柏生物科技有限公司；衍生化試劑：BSTFA (含1% TMCS,V/V)，購自 Regis Technologies，Inc.；甲醇(色譜純，Merck公司)；乙腈(色譜純，Merck公司)；甲酸(色譜級，阿拉丁試劑上海有限公司)；水為超純水，由Milli-Q純水系統制備(美國Milli-Q公司)。

1.3 主要儀器設備 GC色譜儀(Agilent 7890B,美國Agilent公司)；飛行時間質譜儀(LECO Chroma TOF PEGASUS HT,美國LECO公司)；低溫高速離心機(Eppendorf公司)；高速渦旋儀(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

2 方法

2.1 栝樓桂枝湯灌胃液的制備方法 取栝樓桂枝湯顆粒100 g，加入10倍量50%乙醇，加熱回流提取2次，每次1 h，合并濾液減壓蒸餾至無醇味，制得0.9 g·mL-1的栝樓桂枝湯提取液。根據人臨床用量換算成大鼠灌胃給藥劑量為每天3.6 g·kg-1[5]。

2.2 動物分組 實驗動物分為3組：假手術組(S組)、MCAO模型組(M組)、栝樓桂枝湯給藥組(T組)，每組10只，造模后1 h，灌胃給藥栝樓桂枝湯4 mL·kg-1，每天給藥1次，連續給藥7 d，假手術組和模型組給予等容積的生理鹽水。

2.3 大鼠MCAO模型的建立 參考Longa和O Neil的方法[5]：禁食不禁水12 h的SD大鼠用10%水合氯醛麻醉后取仰臥位，取出頸前被毛、進行常規消毒，頸部正中切口，仔細分離左側的頸總動脈(common carotid artery,CCA)，避免損傷迷走神經及頸交感神經，并向上分離頸外動脈(external carotid artery,ECA)和頸內動脈(internal carotid artery,ICA)。在距離頸總動脈分叉較遠處用醫用縫合線結扎總動脈和頸外動脈，將頸總動脈和頸內動脈拉成一直線，用動脈夾暫時阻斷頸內動脈血流，在頸總動脈血管壁上剪一小口，把粗細適中的線栓自頸總動脈切口插入，沿著頸總動脈分叉處緩慢插入頸內動脈，遇有輕微阻力即可。此時線栓的膨大頂端即堵塞大腦中動脈的開口，再用縫合線固定住線栓，常規消毒后縫合皮膚切口。假手術組動物手術步驟類似，但未做線栓閉塞中動脈。造模后的大鼠輕輕轉移到鼠籠中，平躺在室溫墊料上以保持大鼠正常體溫。參照Longa評定法，進行神經功能損傷程度的評價，1～3分代表模型制作成功，可用于實驗。

2.4 樣品收集與前處理 各組動物取血離心，精密吸取50 μL血漿樣本，加入0.2 mL甲醇，再加入10 μL L-2-氯苯丙氨酸，漩渦混勻10 s；緊接著將樣本4 ℃，1 300 rpm離心15 min；小心地取出0.2 mL上清于2 mL進樣瓶(甲烷硅基化的)中，每個樣本各取14 μL混合成QC樣本。在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入30 μL甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg·mL-1)，輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵30 min；向每個樣品中迅速加入40 μL BSTFA(含有1% TCMS，V/V)，將混合物70 ℃孵育2 h；冷卻至室溫，向混樣的樣本中加入10 μL FAMEs(飽和脂肪酸甲酯標準混合液，溶于氯仿C8～C16：1 mg·mL-1；C18～C24：0.5 mg·mL-1)；混勻，上機檢測。

2.5 氣相色譜-飛行時間質譜聯用(GC-TOF-MS)分析 GC-TOF-MS具體分析條件如下：進樣量1 μL，不分流模式；載氣為氦氣；前進樣口吹掃流速為3 mL·min-1；柱流速：1 mL·min；柱溫：50 ℃保持1 min，以每分鐘20 ℃的速率上升至300 ℃，保持6.5 min；前進樣口溫度：280 ℃；傳輸線溫度：270 ℃；離子源溫度：220 ℃；電離電壓：-70 eV；掃描方式：m/z：50→500；掃描速率：20 spectra/sec；溶劑延遲：371 s。

2.6 數據處理 按照上述實驗條件，得到了大鼠血清中內源性代謝物組的GC-TOF-MS數據，運用LECO公司的Chroma TOF 4.3X軟件和LECO-Fiehn Rtx5數據庫，對數據進行原始峰測量、基線校準、基線過濾、峰識別、峰對準、峰面積積分等計算。使用SIMCA軟件(V14.1,MKS Data Analytics Solutions,Umea,Sweden)對歸一化后的數據進行多元變量模式識別分析。數據經多維統計后，找出的差異性代謝物，主要通過檢索NIST質譜庫、HMDB數據庫(http://www.hmdb.ca/)比對、對照品庫比對等方法對生物標志物進行鑒定。

3 結果

3.1 大鼠血漿樣品GC-TOF-MS總離子流圖 在代謝組學中需要對大量樣品進行分析，經過分析大鼠血清樣品的代表性GC-MS總離子流圖如圖1所示。每種物質的峰形良好，峰彼此分離很好，說明分析條件適用于本研究中樣品的檢測。

圖1 大鼠血清樣品的代表性GC-TOF-MS總離子流圖

3.2 多維統計學分析結果

3.2.1 主成分(PCA)分析 色譜質譜數據經過Chroma TOF 4.3X軟件進行數據提取和前處理，使用SIMCA軟件進行多元變量模式識別分析。為了考察MCAO造模造成的大鼠體內代謝變化，首先采用了非監督的PCA方法，PCA分析采用LOG轉換+CTR格式化處理的數據標度換算方式，對數據進行自動建模分析。

在PCA圖中，每一個點代表一個血漿樣品，樣品在空間分布不同代表不同組別樣本的代謝狀況。TOTAL PCA得分圖如圖2所示，結果表明組別之間的區分在得分圖上較為顯著，給藥組樣本在PCA得分圖空間上明顯從模型組向正常對照組方向回歸，樣本全部處于95%置信區間(Hotelling T2 ellipse)內，累計的解釋率R2X=0.344 cum，Q2=0.013 8 cum。模型組與正常組、模型組與給藥組之間在PCA評分圖中顯示出清晰的區分，說明兩組別間的動物在代謝譜上有著顯著性的差異，PCA區分良好。

圖2 TOTAL PCA得分圖

3.2.2 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA) 與無監督的PCA相比，有監督的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)更關注在聚類中做出顯著貢獻的化合物，本實驗進一步采用OPLS-DA來篩選假手術對照組、模型組和給藥組之間的差異代謝物。這種監督的方法建立的模型，可以找到伴隨模型貢獻較大的代謝物變量，最大化地凸顯模型內部與預測主成分(predictive component)相關的差異；M組對S組的OPLS-DA得分圖和置換檢驗圖如圖3所示。代表變量的分數R2X和Q2Y是指模型解釋率和預測準確程度，Q2Y的累計量都接近于1的時候，意味著模型比較理想，有很好的解釋率和預測率。本實驗得到的模型中Q2Y達到0.989，這說明模型的區分程度和預測程度都較好。置換檢驗R2=0.88可以體現出模型具有良好的穩定性，從圖3中可以清晰地看到正常組樣本與模型樣本能完全分開，揭示缺血性腦卒中可導致大鼠的血清代謝組出現顯著代謝變化。同樣，從圖4中可以看出M組對T組的OPLS-DA得分下模型組和給藥組大鼠代謝譜能完全區分。模型的Q2Y達到了0.989，置換檢驗截距R2=0.843同樣體現出所建立的計算模型具有良好的穩定性。

圖3 M組對S組的OPLS-DA得分圖(A)和M組對S組的置換檢驗圖(B)

圖4 M組對T組的OPLS-DA得分圖(C)和M組對T組的置換檢驗圖(D)

3.3 差異代謝物的篩選及鑒定 為了找到與各組別動物高度相關的代謝物，通過OPLS-DA分析過濾掉了不相關的正交信號，獲得OPLS-DA載荷圖，見圖3～4。圖上每一個點代表了樣本中檢測到一個代謝物，距離原點越遠，表示與主成分的差異越大，對組間的分類貢獻越大，載荷圖的左右兩端物質可視引起兩組分類差異的主要代謝物，即為潛在的差異標志物。以第一主成分的VIP值(Variable Importance in the Projection,卡值標準VIP>1)，學生氏t檢驗(Student′s t-test)的P值(P-value，P<0.05)來尋找差異代謝物，并通過檢索NIST質譜庫、HMDB數據庫(http://www.hmdb.ca)比對、對照品比對等方法對差異代謝物進行結構指認，鑒別出這13個差異代謝物見表1。

表1 GLGZD治療的缺血性腦卒中相關的代謝標志物及其代謝途徑

3.4 代謝通路分析 首先將13個差異代謝物通過KEGG、PubChem等常用代謝物數據庫進行映射；接下來選擇大鼠(rattus norvegicus)物種數據庫搜索，最后進行代謝通路富集和拓撲分析，所得通路分析圖見圖5。其中，X軸(pathway impact)代表通路拓撲分析影響因子，Y軸[-log(P)]代表通路富集分析的P值(取負對數)。與此同時，圓圈大小與顏色深淺分別表示通路拓撲分析影響力值和通路富集分析P值(取負對數)；圓圈越大，拓撲分析影響力越大；顏色越深(越紅)，P值越??；反之亦然。如圖5所示，結果表明苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、色氨酸代謝、嘧啶代謝和甘油磷脂代謝是其重要的相關代謝途徑。

圖5 代謝通路分析

4 討論

4.1 栝樓桂枝湯對能量代謝的影響 大腦是碳水化合物和氧氣的主要消耗者，且大腦中無長期的能量儲存，需要持續供應氧氣和葡萄糖來提供能量消耗，因此極易受到血液供應不足的影響。缺血性腦卒中引起的腦缺血阻斷了大腦中氧氣和葡萄糖的供應，破壞了三羧酸(TCA)循環，繼而導致大腦的能量供應模式從有氧代謝轉向無氧代謝[8-10]。結果表明MCAO模型大鼠在給予與GLGZD治療后代謝物中葡萄糖-1-磷酸鹽、海藻糖 6-磷酸、4-乙酰丁酸、N(α)-芐氧羰基-L-亮氨酸含量明顯升高，促進淀粉和蔗糖的代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化，增加缺血、缺氧條件下的能量代謝，同時代謝物吲哚乙酸含量明顯增高、丙二酸含量降低；吲哚乙酸是色氨酸的代謝分解產物，提示GLGZD可能通過促進蛋白質、氨基酸分解代謝來增加能量供應，而丙二酸是競爭性抑制劑，對電子傳遞鏈中的琥珀酸脫氫酶(復合物Ⅱ)起作用，丙二酸下降可降低對能量供應的抑制[11]。

4.2 栝樓桂枝湯對脂質代謝的影響 神經元膜富含多不飽和脂肪酸，對自由基的攻擊特別敏感，而缺血再灌注損傷可導致膜脂質氧化；其中乙醇胺作為神經元中N-酰基-磷脂酰乙醇胺的氧化降解產物，可反應神經膠質細胞的功能障礙和神經元損傷[12-13]。如表1所示，在本實驗中給藥組中的乙醇胺相較之模型組呈下降趨勢，說明給藥組的神經元損傷較輕。肉豆蔻酸是存在于動物中的一種飽和14-碳脂肪酸，可摻入到真核細胞質膜的磷脂雙層的脂?；诵模瑓⑴c并賦予酶的膜定位[14]。在本研究中發現給藥組中的肉豆蔻酸較之模型組明顯升高，提示GLGZD可通過提升細胞膜的恢復能力來減輕神經細胞損傷。

4.3 栝樓桂枝湯對氨基酸代謝的影響 鳥氨酸參與許多代謝途徑，它是尿素循環的核心部分，可以處理過量的氮氣；本實驗中發現給藥組中鳥氨酸含量下降，提示GLGZD可促進鳥氨酸運輸到線粒體中，減少鳥氨酸在細胞質中的積累和提高清除氨甲酰磷酸和氨負荷的能力來減輕神經損傷[15]。在本研究中，與MCAO組相比，GLGZD干預后發現L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸、β-氨基異丁酸等氨基酸代謝物水平增加或減少，改善了腦缺血再灌注損傷引起的氨基酸代謝異常[16]。

綜上，本實驗首次基于GC-TOF-MS的大鼠血清代謝組學分析方法探討栝樓桂枝湯對缺血再灌注大鼠治療作用的代謝組學機制研究，利用多元統計分析PCA和OPLS-DA方法，揭示大鼠血清中內源性小分子化合物的模式變化規律，篩選并鑒定出吲哚乙酸、丙二酸、乙醇胺、肉豆蔻酸、鳥氨酸等13個具顯著差異性的代謝物，可視為GLGZD對MCAO大鼠發揮治療作用的生物標志物，并且栝樓桂枝湯對缺血性腦卒中的保護作用主要反應可能在能量代謝、脂質代謝、氨基酸代謝等代謝途徑的變化，通過促進糖轉化、蛋白氨基酸分解代謝來增加能量供應；提升細胞膜的恢復能力、提高清除氨甲酰磷酸和氨負荷的能力等來減輕神經細胞損傷，改善大鼠腦缺血再灌注損傷癥狀。

致謝：本研究在康復技術協同創新中心國家中醫藥管理局中醫康復研究中心資助下完成。