秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠凋亡及Wnt/β-catenin通路的影響

邢德君 孫慶霞 (吉林省腫瘤醫院內三科，吉林 長春 30000；吉林省前衛醫院檢驗科)

受大氣污染、環境致癌物及吸煙人群等因素的影響，肺癌的發病率逐年增加，其發病率及病死率均居于各類腫瘤的前列，危害巨大〔1〕。肺癌晚期患者的治療主要為化療、放療及靶向治療，其中化療選擇性較差，對人體正常細胞也有較大的影響，易產生惡心嘔吐、骨髓抑制、肝腎功能損害等諸多反應；放療也會導致放射性肺炎、放射性脊髓病、放射性食管炎、放射性心包炎等危害；而靶向治療目前只有少數受體陽性的肺癌患者才能采用，其療效也有待于進一步評估〔2〕。因此，尋找對肺癌敏感的藥物是醫務人員及科研工作者始終關注的焦點問題。

秦皮乙素是從檸檬葉、苦櫪白蠟樹樹皮、地黃、曼陀羅、顛茄等植物中提取的單體成分，又稱6，7-二羥基香豆素，為香豆素的衍生物。現已發現，秦皮乙素具有治療糖尿病、腸道疾病、保肝、化痰平喘、抗氧化、抗菌及抗炎等多種活性〔3〕。近年來，秦皮乙素在腫瘤治療中的應用得到廣泛重視，其對白血病、骨髓瘤、腦膠質瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、腸癌、胰腺癌、肝癌及胃癌等均有治療作用〔4〕。秦皮乙素對人肺癌H460細胞也有一定的抑制作用，但相關研究僅局限于體外實驗，且作用機制并未闡明〔5〕。本研究選擇Lewis肺癌小鼠模型，在秦皮乙素抗肺癌作用的基礎上，探討其與凋亡及Wnt/β-catenin通路的相關性，旨在為臨床肺癌的治療尋找新的低毒、高效的化療藥物。

1 材料與方法

1.1細胞與動物 小鼠Lewis肺癌細胞，購于美國ATCC公司，培養于DMEM培養液中(含10%胎牛血清)。雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，SPF級，購于吉林大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(吉)2016-0001；自由飲水，常規飼養。

1.2藥品與試劑 秦皮乙素〔高效液相色譜法(HPLC)>90%〕，南京道斯夫生物公司，批號：20180225；順鉑注射液，南京制藥公司，批號：20171109；胎牛血清及DMEM培養液，美國Gibco公司；Annexin-V-異硫氨酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒，美國BD公司；逆轉錄試劑盒，上海生科公司；實時定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒，美國BD公司；caspase3、8和9活性測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；β-catenin，Cyclin D1、c-Myc抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗，上海碧云天公司。

1.3主要儀器設備 分析天平(FA2004B)，上海精科公司；CO2培養箱(BPN-150RHP)，上海一恒儀器公司；倒置顯微鏡(IX53)，日本奧林巴斯公司；流式細胞儀(FACSCanto Ⅱ)，美國BD公司；實時熒光定量PCR儀(StepOne TM)，美國ABI公司；紫外/可見分光光度計(6010)，上海惠普儀器公司。

1.4建立小鼠Lewis肺癌模型 將凍存的Lewis肺癌細胞復蘇并培養至對數生長期，在C57BL/6小鼠背側皮下接種(0.2 ml)，2 w后，脫頸處死小鼠。常規消毒，將腫瘤組織剝離，于無菌平皿中剪碎，在組織研磨器中研磨；加入適量4℃生理鹽水，調整Lewis肺癌細胞液濃度為1×107/L。小鼠右腋皮下注射將上述細胞液0.2 ml以建立小鼠Lewis肺癌模型。

1.5分組及給藥 隨機分為模型組、順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組各12只。順鉑組(1 mg/kg)腹腔注射給藥，秦皮乙素高劑量組(100 mg/kg)及秦皮乙素低劑量組(50 mg/kg)灌胃給藥，模型組灌胃等體積溶媒；造模后第2天開始給藥，1次/d，共14 d。

1.6瘤質量及抑瘤率測定 在末次給藥的次日，處死小鼠，無菌條件下將腫瘤組織剝離。用預冷的生理鹽水沖洗，并經濾紙拭干后，稱量瘤質量；按照公式計算抑瘤率。抑瘤率=(1-藥物組瘤質量/模型組瘤質量)×100%。

1.7凋亡率測定 常規方法制備瘤組織單細胞懸液，并用磷酸鹽緩沖液調整細胞密度為1×106個/ml，取100 μl細胞懸液至于1.5 ml離心管中。向離心管中再加入PI和Annexin-V-FITC溶液各5 μl，避光4℃條件下放置30 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8Bax及Bcl-2 mRNA表達測定 取剪碎后的瘤塊組織，Trizol法提取瘤塊組織總RNA，逆轉錄法合成cDNA，引物序列信息如表1所示，由大連寶生物工程有限公司合成。采用實時定量PCR法測定Bax及Bcl-2 mRNA表達水平。擴增條件為：96℃，預變性5 min；96℃變性30 s，62℃退火30 s，70℃延伸30 s，共計35個循環。以β-actin為內參基因，采用2-△△Ct法對所得數據進行定量分析。

表1 引物序列信息

1.9caspase3、8和9活性測定 取剪碎后的瘤塊組織，在冰上加入預冷的裂解緩沖液，制備10%勻漿液。離心(10 000 r/min，5 min)，收集上清液，備用。利用紫外/可見分光光度計，按照試劑盒說明書中的操作步驟，檢測瘤組織caspase3、8和9活性。

1.10Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達測定 取1.9中的10%瘤組織勻漿上清液，采用Western印跡法測定秦皮乙素對荷瘤小鼠瘤組織β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達的影響。二喹啉酸法測定上清液總蛋白濃度后，按比例將上清液與上樣緩沖液混合，加熱煮沸10 min進行變性。加入20 μl蛋白樣品于加樣孔中，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。依次進行轉膜、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、顯色及曝光等操作后；通過與內參蛋白β-actin比較，分析目的蛋白的相對表達水平。

1.11統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠瘤質量及抑瘤率的影響 與模型組比較，順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組瘤質量均顯著降低(均P<0.05)；與順鉑組比較，秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組瘤質量均顯著增加(均P<0.05)。見表2。

表2 各組瘤質量及抑瘤率

與模型組比較：1)P<0.05；與順鉑組比較：2)P<0.05；下表同

2.2秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞凋亡率的影響 與模型組〔(8.75±1.23)%〕比較，順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組腫瘤細胞凋亡率〔(42.14±6.31)%、(33.46±5.80)%、(20.82±3.79)%〕顯著增加(P<0.05)；與順鉑組比較，秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組腫瘤細胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)，且秦皮乙素高劑量組誘導凋亡效果優于秦皮乙素低劑量組。見圖1。

2.3秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織Bax及Bcl-2 mRNA表達的影響 與模型組比較，順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組腫瘤組織Bax mRNA表達顯著增加，而Bcl-2 mRNA表達顯著降低(均P<0.05)；與順鉑組比較，秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組腫瘤組織Bax mRNA表達顯著降低，而Bcl-2 mRNA表達顯著增加(均P<0.05)。見表3。

2.4秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織caspase3、8和9活性的影響 與模型組比較，順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組caspase3、8和9活性均顯著增加(均P<0.05)；與順鉑組比較，秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組caspase3、8和9活性均顯著降低(均P<0.05)。見表3。

2.5秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的影響 與模型組比較，順鉑組、秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達被明顯抑制，表達量均顯著降低(均P<0.05)；與順鉑組比較，秦皮乙素高劑量組及秦皮乙素低劑量組β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表達均顯著增加(均P<0.05)。見表4和圖2。

圖1 秦皮乙素對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞凋亡率的影響

組別BaxBcl-2caspase3(U/mg)caspase8(U/mg)caspase9(U/mg)模型組0.41±0.050.74±0.090.54±0.070.45±0.050.24±0.02順鉑組1.13±0.201)0.23±0.031)1.87±0.221)0.98±0.131)0.62±0.071)秦皮乙素高劑量組0.97±0.141)2)0.32±0.041)2)1.69±0.151)2)0.77±0.081)2)0.56±0.061)2)秦皮乙素低劑量組0.86±0.111)2)0.59±0.081)2)1.31±0.211)2)0.62±0.091)2)0.45±0.041)2)

表4 各組腫瘤組織Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達

圖2 Western印跡檢測秦皮乙素各組腫瘤組織Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達

3 討 論

腫瘤細胞凋亡過程受阻是腫瘤發生的重要因素〔6〕。本研究提示秦皮乙素抑制Lewis肺癌小鼠的腫瘤生長與誘導凋亡作用有關。Bcl-2基因家族在線粒體通路調控細胞凋亡進程中有關鍵性重要作用，其中Bax和Bcl-2是功能截然相反的兩個基因，Bax可促進細胞發生凋亡，而Bcl-2主要抑制細胞凋亡進程，二者共同調控線粒體功能介導的細胞凋亡〔7〕。本研究證明秦皮乙素可誘導Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞發生凋亡。秦皮乙素還可抑制肺瘤小鼠腫瘤組織caspase3、8和9的活性。caspase3的活化標志著凋亡進入不可逆階段，是細胞凋亡的主要效應分子，為caspase家族中最為重要的凋亡執行者〔8〕。caspase8具有活化下游caspase3、6和7的作用，而caspase9可以與凋亡相關因子1結合聚合形成凋亡小體，進而誘導細胞發生凋亡〔9〕。本研究結果表明，秦皮乙素抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤生長的作用與誘導凋亡有關。Wnt信號通路包括Wnt/β-catenin信號通路、平面細胞極性信號通路及Wnt/Ca2+信號通路，其中經典的Wnt/β-catenin信號通路參與調控腫瘤細胞的凋亡、周期及增殖等過程〔10〕。研究表明〔11〕，Wnt/β-catenin信號通路的異常活化與肺癌、前列腺癌、膀胱癌、結腸癌等相關，其中Wnt信號通路中最關鍵的轉導因子β-catenin，參與調控細胞凋亡、分化、生長及黏附等過程。β-catenin活化后，下游Cyclin D1、c-Myc等效應分子表達增加，導致腫瘤發生〔12〕。另有研究表明〔13〕，肺癌與Wnt/β-catenin信號通路關系密切，可影響肺癌的惡性程度，決定著患者生存與預后情況。因而，Wnt/β-catenin信號通路可作為肺癌治療的靶點，抑制該通路的激活，可起到抗肺癌作用〔14〕。本研究表明秦皮乙素具有抑制Wnt/β-catenin通路活化的作用。綜上，秦皮乙素可通過誘導凋亡及抑制Wnt/β-catenin通路激活，發揮抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤生長的作用，但具體機制還有待于深入研究。