miR-370靶向FoxO1抑制TNF-α 誘導的肝癌細胞增殖、遷移和侵襲

錢麗麗 閆秀明 張慧 張改 (河南醫學高等專科學校檢驗系微免教研室，河南 鄭州 451191)

肝癌為全球病死率最高的惡性腫瘤，中國每年約有38.3萬人死于該病，其死亡數占世界肝癌死亡量的1/2，致死率僅次于肺癌居第二位〔1,2〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α涉及細胞凋亡和細胞增殖，不僅作為促炎細胞因子參與廣泛的人類疾病，包括炎癥性疾病，也可導致腫瘤的發展〔3,4〕。miRNA為19～25 個核苷酸組成的短鏈內源性非編碼RNA，在腫瘤的發生發展中具有重要的調控作用〔5〕。大量研究報道，miR-370在肝癌中發揮抑制癌癥惡化的作用〔6〕，但其作用機制尚未完全清楚。叉頭框基因(Fox)廣泛存在于各種真核生物細胞中，其中FoxO1為Fox基因家族中的一員〔7,8〕。研究報道，促進FoxO1在肝癌中的轉錄可抑制肝癌的惡化〔9〕。本研究觀察TNF-α處理后HepG-2細胞的增殖、遷移和侵襲情況，并觀察過表達FoxO1、抑制miR-370、敲減FoxO1對HepG-2細胞的增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞HepG-2購自美國模式菌種收集中心；DMEM高糖培養基、胎牛血清(FBS)、溴化噻唑藍四氮唑(MTT)、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；基質膠、Transwell小室購自美國Corning公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、電化學發光液和放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液均購自上海碧云天生物技術公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2細胞培養 將肝癌細胞HepG-2培養于含10%FBS的DMEM高糖培養基(含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，置于37℃、5% CO2的恒溫培養箱中常規培養，待細胞生長至融合度達到75%左右，用胰蛋白酶消化，每2 d傳代1次。

1.3細胞處理與分組 用TNF-α (20 ng/ml)處理肝癌細胞HepG-2 48 h，標記為TNF-α組；pcDNA、pcDNA-FoxO1、anti-miR-con、anti-miR-370、anti-miR-370+si-con、anti-miR-370+si-FoxO1，按照LipofectamineTM2000轉染說明書操作步驟轉染至HepG-2細胞，轉染后用20 ng/ml的TNF-α培養48 h，分別標記為TNF-α+pcDNA組、TNF-α+pcDNA-FoxO1組、TNF-α+anti-miR-con組、TNF-α+anti-miR-370組、TNF-α+anti-miR-370+si-con組、TNF-α+anti-miR-370+si-FoxO1組，實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)實驗檢測轉染效率。確認轉染成功后，用于后續試驗。

1.4qRT-PCR實驗 取適量對數生長期轉染和(或)TNF-α處理的各組HepG-2細胞，遵照RNA抽提試劑盒說明書要求操作提取細胞RNA，檢測含量，然后以RNA為模板按逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA，檢測濃度。最后根據qRT-PCR試劑盒說明書進行FoxO1 mRNA和miR-370的檢測。用2-△△Ct法計算miR-370、FoxO1的表達水平。

1.5Western印跡實驗 收集轉染和(或)TNF-α 處理的各組HepG-2細胞，加入RIPA裂解液，裂解30 min。12 000 r/min離心10 min，收集蛋白上清。取適量蛋白上清至EP管，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，進行SDS-PAGE后將蛋白條帶用轉膜儀轉移至PVDF膜；置于5 %脫脂奶粉封閉2 h，洗膜3次，加入稀釋的Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜，洗膜3次，加稀釋的酶標Ⅱ抗，4 ℃ 孵育2 h。加發光液，曝光。

1.6MTT實驗 取對數生長期轉染和(或)TNF-α 處理的各組HepG-2細胞，以2×103個細胞/孔接種于96微孔板中，在培養至24 h、48 h、72 h時進行 MTT 實驗，每孔加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培養4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩，溶解結晶，酶標儀在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。

1.7Transwell小室檢測細胞遷移侵襲 遷移實驗：將轉染和(或)TNF-α 處理的各組HepG-2細胞以106個/孔接種于6孔板，常規培養細胞融合度至80%，更換為無血清培養基過夜饑餓培養。培養液稀釋各組細胞密度至105個/ml，Transwell上室加入100 μl細胞，下室加入600 μl含FBS的DMEM培養基，細胞常規培養12～18 h。取出上層小室，用棉簽擦去上室內未遷移的細胞，PBS洗滌2次，甲醇固定遷移細胞30 min，0.1%結晶紫染色20 min。顯微鏡觀察遷移細胞，隨機選取3個視野拍照，計數，取平均數。侵襲實驗：將Transwell上層小室內鋪適量厚度的基質膠，后續步驟同遷移實驗，顯微鏡觀察并計數小室下表面附著的侵襲細胞。

1.8雙熒光素酶報告基因檢測實驗 采用在線靶基因預測庫target scan(http://www.targetscan.org/)檢測到miR-370與FoxO1 3′非編碼區(UTR)存在結合位點，為了驗證這一預測，構建FoxO1 3′UTR-WT(含FoxO13′UTR片段)和FoxO1 3′UTR-MUT(含FoxO1 3′UTR片段突變體)的熒光素酶報告載體，根據1.3方法分別將FoxO1 3′UTR-WT和FoxO1 3′UTR-MUT與miR-370 mimics和miR-con共轉染細胞，標記為miR-370組、miR-con組，培養24 h，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行操作，檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶激發值，以兩者的比值評價FoxO1基因突變型和野生型的熒光素酶相對活性。

1.9統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1TNF-α促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲 與Con組相比，TNF-α組肝癌HepG-2細胞在48 h和72 h細胞OD值顯著升高，遷移和侵襲細胞數均顯著升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。見表1。

組別OD490 nm24 h48 h72 h遷移細胞數(個)侵襲細胞數(個)Con組0.36±0.040.52±0.060.79±0.0884.74±8.5664.37±7.13TNF-α組0.42±0.030.71±0.051.24±0.06188.32±15.43140.38±9.74t/P值2.079/0.1064.214/0.0147.794/0.00210.167/0.00110.907/0.000

2.2TNF-α抑制FoxO1表達 與Con組相比，TNF-α組HepG-2細胞FoxO1 mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見圖1、表2。

圖1 Con組和TNF-α組肝癌細胞FoxO1蛋白的表達

表2 TNF-α對肝癌細胞FoxO1表達的影響

組別FoxO1 mRNAFoxO1蛋白Con組1.12±0.110.55±0.05TNF-α組0.45±0.310.26±0.03t/P值3.528/0.0248.614/0.001

2.3過表達FoxO1可抑制TNF-α對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用 與TNF-α+pcDNA組相比，TNF-α+pcDNA-FoxO1組HepG-2細胞中FoxO1蛋白表達顯著上升(P<0.001)。在處理后48 h和72 h細胞OD值顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數均顯著下降(P<0.01)。見表3和圖2。

組別FoxO1蛋白細胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h遷移細胞數(個)侵襲細胞數(個)TNF-α+pcDNA組0.33±0.040.40±0.040.75±0.061.15±0.12175.63±17.94131.78±12.72TNF-α+pcDNA-FoxO1組0.86±0.030.37±0.030.58±0.050.84±0.0887.27±8.8369.59±7.47t/P值18.360/0.0001.039/0.3573.77/0.0203.723/0.0207.654/0.0027.302/0.002

2.4miR-370靶向FoxO1 運用target scan庫預測miR-370與FoxO1的結合發現，miR-370與FoxO1 3′UTR序列中存在結合位點(圖3A)；雙熒光素酶報告系統檢測結果顯示，與miR-con組相比，miR-370組的FoxO1野生型WT-FoxO1細胞中熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而突變型MUT-FoxO1細胞中熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)，見表4。與miR-con組(0.56±0.05)相比，過表達miR-370組細胞中FoxO1蛋白表達(0.27±0.03)顯著降低(P<0.05)，與anti-miR-con組(0.58±0.06)相比，anti-miR-370組細胞中FoxO1蛋白表達(0.92±0.08)顯著升高(P<0.05)。圖3B。

2.5抑制miR-370可抑制TNF-α對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用 與TNF-α+anti-miR-con組相比，TNF-α+anti-miR-370組HepG-2細胞中miR-370表達顯著降低(P<0.001)，在處理后48、72 h細胞增殖顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數均顯著降低(P<0.01)。見表5。

圖3 miR-370靶向FoxO1

表4 雙熒光素酶報告實驗

組別WT-FoxO1MUT-FoxO1miR-con組1.03±0.111.07±0.11miR-370組0.42±0.061.11±0.13t/P值8.432/0.0010.407/0.705

組別miR-370細胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h遷移細胞數(個)侵襲細胞數(個)TNF-α+anti-miR-con組0.93±0.090.41±0.040.76±0.061.19±0.11174.74±15.56134.32±11.13TNF-α+anti-miR-370組0.23±0.020.39±0.030.55±0.050.89±0.09101.32±6.4380.75±5.81t/P值13.151/0.0000.693/0.5274.657/0.0103.656/0.0227.553/0.0027.390/0.002

2.6抑制miR-370和沉默FoxO1對TNF-α促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與TNF-α+anti-miR-con組相比，TNF-α+anti-miR-370組HepG-2細胞在處理后48和72 h細胞OD值顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數均顯著降低(P<0.05)；與TNF-α+anti-miR-370+si-con組相比，TNF-α+anti-miR-370+si-FoxO1組HepG-2細胞在處理后48和72 h細胞OD值顯著升高(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數均顯著升高(P<0.05)。見表6。

組別細胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h遷移細胞數(個)侵襲細胞數(個)TNF-α+anti-miR-con組0.42±0.040.87±0.061.18±0.12185.37±17.49135.78±11.71TNF-α+anti-miR-370組0.36±0.030.56±0.051)0.78±0.081)81.27±8.531)62.59±7.641)TNF-α+anti-miR-370+si-con組0.39±0.030.59±0.050.79±0.0884.27±8.3865.55±7.37TNF-α+anti-miR-370+ si-FoxO1組0.40±0.040.83±0.062)1.02±0.122)145.72±11.082)113.44±12.582)F/P值1.500/0.28725.205/0.00010.776/0.00453.395/0.00038.415/0.000

與TNF-α+anti-miR-con組比較:1)P<0.05；與TNF-α+anti-miR-370+si-con組比較:2)P<0.05

3 討 論

TNF-α由巨噬細胞、自然殺傷細胞及中性粒細胞等分泌的促炎因子，在人類多種疾病中發揮作用，包括腫瘤〔10〕。有研究報道，TNF-α在腫瘤中具有雙向的作用，其抗腫瘤作用或促腫瘤作用與TNF-α的濃度有很大關系，高濃度TNF-α可通過分泌特異性T細胞、破壞腫瘤血管生成而發揮抗腫瘤作用，低濃度TNF-α可激活核細胞因子(NF)-κB信號通路發揮促腫瘤作用〔11,12〕。Hu等〔13〕報道，聚碳酸酯磁性微球對TNF-α具有強磁響應性和高TNF-α負載濃度，且對異種植瘤的裸鼠體內具有高抑制和抗腫瘤作用。雷一鳴等〔14〕在肝癌的研究中發現，TNF-α在肝癌組織中表達升高，且可通過上調芐氟素(BECN)1、微管相關蛋白(LC3B)、增殖細胞核抗原(PCNA)的表達，促進癌細胞增殖。

miRNA在腫瘤中發揮腫瘤基因或腫瘤抑制基因的作用，這在國內外均得到普遍認可〔15〕。miR-370在腫瘤中的調節較復雜，蘭敏〔16〕報道，miR-370在多種腫瘤的發生、發展、轉移及耐藥中均具有調節作用，如在肝癌、口腔癌、膀胱癌中下調發揮抑癌作用，在甲狀腺癌、子宮內膜癌中上調發揮致癌作用，而在胃癌、肺癌中既具有上調作用也具有下調作用〔17〕。孫戈等〔18〕報道，miR-370在肝癌中表達顯著下調，且與肝癌的惡性指標及生存率密切相關。Pan等〔19〕在肝癌的研究中發現，miR-370在肝癌組織中的表達顯著降低，且與腫瘤的淋巴轉移、分期及總體生存率顯著相關，提示，miR-370的水平可作為臨床評估的獨立預后標志物。本研究發現，抑制miR-370可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，推測其可能與調控TNF-α的表達有關。

FoxO1基因在機體各種組織器官中廣泛表達，參與細胞凋亡、DNA損傷修復、免疫調節及氧化應激等生物學過程〔20,21〕。FoxO1在多種腫瘤中表現為下調，發揮抑癌作用，其中包括肝癌〔22,23〕。張國強等〔24〕在肝癌的研究中發現，LINC00598、FoxO1在肝癌中表達均異常降低，且可上調肝癌的風險系數，提示LINC00598可抑制肝癌的惡化，其可能與順勢調控FoxO1的表達有關。Jiang等〔25〕在肝癌的研究中發現，三氟拉嗪(TFP)可抑制肝癌細胞的活力，誘導細胞周期停滯于G0/G1期和細胞凋亡，下調細胞遷移或侵襲的能力，且將FoxO1的細胞質定位逆轉為核定位并增加其在核中的表達，敲低FoxO1可顯著逆轉TFP誘導的細胞凋亡，此外，TFP可增加FoxO1的核定位，提示上調FoxO1在肝癌中可發揮抗腫瘤作用。本研究發現，過表達FoxO1在肝癌的惡性進程中發揮抑制作用，敲減FoxO1可促進肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲。

綜上，miR-370可靶向FoxO1調控TNF-α對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響，miR-370可能是肝癌的新靶標。