培哚普利和螺內酯對大鼠糖尿病腎病水通道蛋白表達的影響

莫娜 王正義 童麗靈 (?？谑腥嗣襻t院內科，海南 ?？?571100)

糖尿病腎病是常見的慢性腎臟疾病之一，會逐漸導致腎功能障礙〔1〕。糖尿病腎病常見特征是腎小球濾過屏障受損導致持續蛋白尿。臨床上糖尿病腎病患者會逐漸出現蛋白尿，進而出現腎功損傷，最終導致腎衰竭〔2，3〕。糖尿病是一種常見的內分泌疾病,以往一直認為糖尿病患者多尿癥狀是由高血糖引起的滲透性利尿，而新近研究發現水通道蛋白(AQPs)也在其尿液濃縮過程及水代謝失調中發揮重要作用〔4〕。本研究旨在探討培哚普利和螺內酯對糖尿病腎病AQP表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 雄性SD大鼠72只，體重(200±20)g，適應性飼養1 w，室溫18～22℃，濕度50%～70%，自由飲水；培哚普利片購自施維雅天津制藥有限公司，螺內酯片購自張家口云峰藥業有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司，尿蛋白定量試劑盒購自上海通蔚生物科技有限公司，肌酐試劑盒購自海通蔚生物科技有限公司，AQP1、AQP2、AQP3、AQP4試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司，AQP1、AQP2、AQP3、AQP4多克隆抗體購自上海超研生物科技有限公司。血糖儀購自美國LifeScan，酶標儀購自美國BioRad。

1.2糖尿病腎病模型制備 高脂飼料(脂肪40%、蔗糖20%、蛋白質3%與大鼠普通粉料混合)喂養4 w后，給予STZ 50 mg/kg(用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液0.1 mol/L配制一次性腹腔注射)。正常組注射等體積的檸檬酸緩沖液。于注射STZ 72 h后斷尾取血測定血糖值，隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型制備成功。再喂養4 w，收集24 h尿液24 h尿蛋白≥30 h則說明糖尿病腎病模型制備成功。將造模成功的48只大鼠隨機分為模型組、培哚普利組、螺內酯組、培哚普利聯合螺內酯組各12只，正常組12只。模型組和正常組等劑量生理鹽水灌胃；培哚普利組給予2 mg/(kg·d)培哚普利灌胃；螺內酯組給予50 mg/(kg·d)螺內酯灌胃；培哚普利聯合螺內酯組給予2 mg/(kg·d)培哚普利+50 mg/(kg·d)螺內酯灌胃。連續8 w。

1.3方法 于結束前1 d，采取且計算24 h尿量；腹腔主動脈取血，離心，1 500 r/min，分離血清標本，置于-20℃下保存待測。取上述血清標本測定空腹血糖(FPG)。采用酶法測定血肌酐含量；取上述尿液標本，離心，去除沉渣，采用鄰苯三酚紅/鉬酸鹽法測定24 h尿蛋白量。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量。Western印跡測定AQP1、AQP2、AQP3、AQP4蛋白表達：給予大鼠50 mg/kg 1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，取腎臟髓質，于-70℃下保存待測。用蛋白裂解液提取組織總蛋白，采用考馬斯亮藍蛋白定量，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，然后將其轉移蛋白到硝酸纖維素膜上。采用5%脫脂奶粉封閉，加入AQP1、AQP2、AQP3、AQP4多克隆抗體(1∶200)孵育，放置于4℃下過夜。再加入二抗(1∶2 000)孵育2 h。以電化學發光(ECL)法顯影，圖像掃描后，再以Quantitiy one圖像分析軟件分析條帶灰度。

1.4統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1各組FPG比較 模型組FPG水平〔(26.52±4.32)mmol/L〕、培哚普利組〔(14.39±2.12)mmol/L〕、螺內酯組〔(13.98±1.97)mmol/L〕和培哚普利聯合螺內酯組〔(11.41±1.38)mmol/L〕顯著高于正常組〔(9.32±1.20)mmol/L，P<0.05〕；培哚普利組、螺內酯組和培哚普利聯合螺內酯組FPG顯著低于模型組(P<0.05)；培哚普利聯合螺內酯組FPG顯著低于培哚普利組、螺內酯組(P<0.05)。

2.2各組血肌酐和24 h尿蛋白量比較 模型組、培哚普利組、螺內酯組和培哚普利聯合螺內酯組血肌酐和24 h尿蛋白量顯著高于正常組(P<0.05)；培哚普利組、螺內酯組和培哚普利聯合螺內酯組血肌酐和24 h尿蛋白量顯著低于模型組(P<0.05)；培哚普利聯合螺內酯組血肌酐和24 h尿蛋白量顯著低于培哚普利組、螺內酯組(P<0.05)。見表1。

表1 各組血肌酐和24 h尿蛋白量比較

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與培哚普利組和螺內酯組比較:3)P<0.05;下表同

2.3各組尿液AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量比較 模型組、培哚普利組、螺內酯組和培哚普利聯合螺內酯組尿液AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量顯著高于正常組(均P<0.05)；培哚普利組、螺內酯組和培哚普利聯合螺內酯組尿液AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量顯著低于模型組(均P<0.05)；培哚普利聯合螺內酯組尿液AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量顯著低于培哚普利組、螺內酯組(均P<0.05)。見表2。

組別AQP1AQP2AQP3AQP4正常組14.38±2.2917.92±1.9723.14±4.5612.31±2.04模型組41.32±6.781)38.63±3.251)51.32±6.981)29.42±3.871)培哚普利組27.81±4.251)2)26.14±2.081)2)37.82±5.491)2)20.19±3.251)2)螺內酯組28.19±5.101)2)25.43±3.291)2)36.90±5.211)2)20.56±3.011)2)培哚普利聯合螺內酯組19.15±2.571)2)3)20.19±1.421)2)3)29.37±3.261)2)3)15.42±2.311)2)3)

2.4各組腎組織AQP1、AQP2、AQP3、AQP4表達比較 模型組、培哚普利組、螺內酯組和培哚普利聯合螺內酯組AQP1、AQP2、AQP3、AQP4表達灰度值顯著高于正常組(均P<0.05)；培哚普利組、螺內酯組和培哚普利聯合螺內酯組AQP1、AQP2、AQP3、AQP4表達灰度值顯著低于模型組(均P<0.05)；培哚普利聯合螺內酯組AQP1、AQP2、AQP3、AQP4表達灰度值顯著低于培哚普利組、螺內酯組(均P<0.05)。見表3。

組別AQP1AQP2AQP3AQP4正常組0.17±0.030.25±0.040.19±0.020.13±0.03模型組0.61±0.141)0.56±0.081)0.51±0.101)0.53±0.121)培哚普利組0.37±0.071)2)0.40±0.051)2)0.35±0.061)2)0.31±0.061)2)螺內酯組0.38±0.091)2)0.39±0.081)2)0.36±0.081)2)0.32±0.071)2)培哚普利聯合螺內酯組0.25±0.051)2)3)0.31±0.031)2)3)0.25±0.031)2)3)0.21±0.091)2)3)

3 討 論

隨著近年來人們飲食結構和生活水平的不斷改善，糖尿病發病率呈不斷上升趨勢，嚴重影響人們生活質量〔5,6〕。糖尿病腎病是糖尿病重要的一種并發癥，且導致糖尿病死亡的主要原因之一〔7〕。但目前對糖尿病腎病具體發病機制尚不十分明確。培哚普利和螺內酯分別作為腎素-血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和醛固酮抑制劑，前者主要通過阻斷腎素-血管緊張素系統使醛固酮分泌減少，增加鈉的排出，同時降低腎小球內壓增加腎血流量，使尿量增加〔8～10〕。而后者螺內脂主要是通過直接抑制醛固酮，使腎小管對鈉重吸收減少，排鈉增加，也使尿量增加，二者對糖尿病腎病水調節代謝機制有相似之處，即通過抑制醛固酮機制〔11～13〕。本研究提示培哚普利和螺內酯可降低FPG、血肌酐和24 h尿蛋白量含量。

但培哚普利和螺內酯是否還存在對AQP的調節作用目前仍未完全闡明。近年來，位于細胞膜上的特異性水轉運孔道——AQP家族的發現為研究細胞膜水通透性的分子機制提供了新的視角。研究發現AQP的表達及功能改變將會影響特定細胞膜的水轉運，而各種各樣的多尿癥及不同形式水腫的病理生理過程均與AQP有關，同時AQP還為疾病治療與水平衡調節的研究提供了理論基礎〔14,15〕。本研究提示培哚普利和螺內酯可降低尿液及腎組織AQP含量。

綜上，培哚普利和螺內酯對糖尿病腎病大鼠腎臟具有一定保護作用，且機制可能與降低尿液AQP水平及抑制腎組織AQP表達有關。