酸棗仁加鋅合劑對(duì)睡眠剝奪大鼠下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響

張紅石 馬天姝 祝恩智 (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新實(shí)踐中心，吉林 長(zhǎng)春 130017)

睡眠剝奪(SD)狀態(tài)勢(shì)必會(huì)嚴(yán)重影響員工的職業(yè)能力和職業(yè)壽命〔1～3〕。目前臨床上還沒有明確針對(duì)SD的調(diào)養(yǎng)方案。中藥酸棗仁有較好的促進(jìn)睡眠、養(yǎng)心安神的效果，可以有效促進(jìn)人體睡眠〔4，5〕。酸棗仁加鋅合劑可以有效改善SD后小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔6～8〕，但缺乏基礎(chǔ)研究。下丘腦為人體多種生物調(diào)節(jié)節(jié)律中樞，星形膠質(zhì)細(xì)胞(AS)對(duì)其有明確的保護(hù)作用〔9〕。

AS廣泛分布于腦的各個(gè)部位。在丘腦，AS占整個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞的30%～40%。AS參與了人體生物鐘的調(diào)節(jié)作用。目前AS分原漿性AS和纖維性AS。兩者雖然形態(tài)、分布不完全一樣，但功能上幾乎相同。本研究擬分析酸棗仁加鋅合劑對(duì)SD大鼠下丘腦AS細(xì)胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 清潔級(jí)10月齡Wistar大鼠50只，雌雄各半，體重(180±20)g，均購于維通利華(許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0004)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于潔凈動(dòng)物籠中，相對(duì)濕度50%～60%，溫度(22±3)℃，人工照明，食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。試劑及儀器：改良Bielschowsky銀神經(jīng)染色試劑盒：Leagene Biotechnology CoDK0015.Ltd：試劑(A)Bielschowsky 硝酸銀溶液50 ml；試劑(B)：還原劑 250 ml；試劑(C)：Bielschowsky氨銀溶液50 ml；試劑(D)：氯化金溶液 50 ml；試劑(E)：海波溶液 50 ml。酸棗仁加鋅合劑組制備：按專利酸棗仁加鋅合劑專利配方進(jìn)行制作。酶標(biāo)儀：伯騰酶標(biāo)儀BIOTek-SMAT;組織切片機(jī)：LEICA EG1150H；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒:Rat GFAP ELISA KIT30024153。

1.2造模 水上站立法〔10〕造模。剝奪強(qiáng)度為24 h/d。將大鼠放入水深2～5 cm的塑料籠內(nèi)，每籠放5只大鼠，出現(xiàn)節(jié)律性垂頭觸水而覺醒，如此反復(fù)從而造成大鼠難以進(jìn)入睡眠狀態(tài)導(dǎo)致SD。

1.3分組與給藥 按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組、高劑量組、低劑量組，每組10只。模型組:連續(xù)7 d灌胃(清水)；陽性藥組：連續(xù)7 d灌胃葡萄糖酸鋅口服液；高劑量組：連續(xù)7 d灌胃高劑量的酸棗仁加鋅合劑；低劑量組：連續(xù)7 d灌胃低劑量的酸棗仁加鋅合劑；以上各組正常喂養(yǎng)，7 d后進(jìn)行24 h SD。ELISA檢測(cè)血清膠原纖維酸性蛋白(GFAP)水平，并進(jìn)行銀染。計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血清GFAP水平比較 空白組、陽性藥組、低劑量組及高劑量組GAFP水平(OD值：0.31±0.09、0.52±0.12、0.49±0.11、0.52±0.17)與模型組(0.37±0.11)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.78、2.91、2.44、2.34、均P<0.05)。

2.2AS銀染 空白組下丘腦AS細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞大小均勻，細(xì)胞間突觸連接較少。模型組細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)活躍，出現(xiàn)雜亂、新的突觸連接。陽性藥物組、低劑量組、高劑量組與模型組比較，細(xì)胞排列相對(duì)整齊，突觸連接較為規(guī)律，見圖1。

圖1 SD 24 h后大鼠AS銀染(×400)

3 討 論

SD機(jī)制研究較為少見，阻礙了其臨床應(yīng)用〔11～13〕。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量是神經(jīng)元的10～50倍，在睡眠過程中，AS可以在谷氨酸誘導(dǎo)下以鈣離子依賴的胞吐方式釋放ATP，參與腦的能量代謝〔14,15〕。AS對(duì)睡眠-覺醒周期的維持及AS對(duì)睡眠能量代謝的作用，說明該細(xì)胞與睡眠存在較為密切的關(guān)系〔16〕。GFAP是AS的骨架蛋白，被公認(rèn)為是AS的特征性標(biāo)志物。

本研究表明，當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于SD狀態(tài)時(shí)，AS開始發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，活性開始升高，且藥物有提高AS活性的作用。進(jìn)而對(duì)腦組織起到保護(hù)、支持、營(yíng)養(yǎng)的作用。

中藥飲食調(diào)理是中醫(yī)“治未病”的重要體現(xiàn)，其不同于藥物治療和心理暗示，是將藥物融于食物，有效緩解疾病狀態(tài)的一種有效方法，目前針對(duì)性的基礎(chǔ)研究較為少見。本課題組發(fā)現(xiàn)酸棗仁加鋅合劑有較好的對(duì)抗SD狀態(tài)的作用，可以起到養(yǎng)心安神保護(hù)大腦各項(xiàng)功能的作用，減少SD帶來的腦組織損傷，其作用機(jī)制與AS活性密切相關(guān)。