調(diào)控線粒體膜電位青蒿琥酯誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡作用

陳樂彤 劉江惠 劉亮 王靜 徐志彬

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 1腫瘤研究所，河北 石家莊 050011；2內(nèi)鏡科)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，居消化道惡性腫瘤發(fā)病率第一位，且病死率高〔1，2〕，目前，手術(shù)、化療及放療仍是胃癌的常規(guī)治療方法。手術(shù)是胃癌的首選治療方法，但在目前，較多的胃癌患者初診時(shí)已是中晚期，無法進(jìn)行手術(shù)治療，對(duì)于這些患者，化療就成為其最主要的治療方法之一，但是由于化療藥物的高毒副作用及多藥耐藥性，往往影響化療的療效，甚至導(dǎo)致化療失敗。因此，尋找高效、低毒的抗胃癌藥，可有效地提高胃癌患者治療效果，延長(zhǎng)患者生存期。在中國(guó)利用中草藥進(jìn)行腫瘤治療已具有悠久歷史，且其具有低毒、高效、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)。青蒿琥酯(Art)是青蒿素的一種衍生物，主要來源于植物黃花蒿。Art是高效低毒的抗瘧疾藥物，且在耐藥及重型瘧疾治療上具有較大的優(yōu)勢(shì)，治療效果較佳〔3～5〕，隨著對(duì)Art的進(jìn)一步深入研究，發(fā)現(xiàn)，Art除了具有抗瘧疾作用以外，其還具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等作用〔6～9〕。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，Art對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用〔10，11〕，但在胃癌細(xì)胞中的研究較少，且具體機(jī)制尚未闡明。本文主要利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過Art干預(yù)胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)，研究Art是否具有抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用，并進(jìn)一步探討其抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Beckman Coulter公司；Art，中國(guó)桂林南藥股份有限公司；小鼠抗人B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2及B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)蛋白(Bax)抗體，美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體，中國(guó)北京中杉金橋公司；若丹明(Rho)123，中國(guó)北京索萊寶科技有限公司；人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，中國(guó)中科院上海細(xì)胞庫(kù)。FC500型流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2方法

1.2.1Art干預(yù)SGC-7901細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌SGC-7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，將1 ml細(xì)胞懸液接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，帶細(xì)胞貼壁后，且細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入不同濃度Art，使藥物終濃度分別達(dá)到30、60、120 μmol/L，生理鹽水代替Art作為對(duì)照組。Art干預(yù)細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2Art干預(yù)SGC-7901細(xì)胞后細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取上述制備的單細(xì)胞懸液1 ml，含1×106細(xì)胞。利用冷PBS洗細(xì)胞1次，去除上清液，冷1×結(jié)合緩沖液100 μl 懸浮細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 試劑10 μl，4℃避光放置15 min，而后加入1×結(jié)合緩沖液380 μl，隨后加入碘化丙啶(PI)染液10 μl 4℃避光放置15 min，冷PBS洗滌細(xì)胞1次，1ml PBS懸浮細(xì)胞后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3Art干預(yù)SGC-7901細(xì)胞后細(xì)胞中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白檢測(cè) 取上述制備的單細(xì)胞懸液1 ml，含1×106細(xì)胞，冷PBS洗滌細(xì)胞1次，PBS 100 μl懸浮細(xì)胞，放入流式細(xì)胞儀上樣管中，設(shè)置3個(gè)平行管。分別向其中加入小鼠抗人Bcl-2、Bax及兔抗人Caspase-3抗體100 μl，室溫放置30 min，而后PBS洗滌細(xì)胞1次(1 000 r/min，5 min)，去除上清液后，100 μl PBS液懸浮細(xì)胞，分別向每管中加入羊抗小鼠及羊抗兔IgG-FITC熒光二抗，室溫避光放置30 min，PBS洗滌細(xì)胞1次(1 000 r/min，5 min)，去除上清液后，1 ml PBS液懸浮細(xì)胞，300目尼龍網(wǎng)過濾后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞。同時(shí)設(shè)置只加IgG-FITC二抗不加一抗的同型對(duì)照組。以平均熒光強(qiáng)度表示蛋白表達(dá)量。

1.2.4Art干預(yù)SGC-7901細(xì)胞后細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè) 取上述制備的單細(xì)胞懸液1 ml，含1×106細(xì)胞，冷PBS洗滌細(xì)胞1次，PBS 100 μl懸浮細(xì)胞，放入流式細(xì)胞儀上樣管中，向上樣管加入Rho 123染料，使終濃度達(dá)到10 μg/ml，37℃ 下避光放置30 min，PBS洗滌細(xì)胞1次后，1 ml PBS懸浮細(xì)胞，300目尼龍網(wǎng)過濾后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位水平以平均熒光強(qiáng)度表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行方差分析，LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Art誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡 30、60、120 μmol/L Art干預(yù)胃癌SGC-7901細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率分別為〔(5.48±0.67)%、(12.55±1.17)%、(23.43±2.18)%〕顯著高于對(duì)照組〔(0.87±0.14)%,P<0.05〕；120 μmol/L Art組細(xì)胞凋亡率顯著高于30及60 μmol/L Art組(P<0.05)，見圖1。

圖1 青蒿琥酯作用SGC-7901細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡

2.2Art下調(diào)SGC-7901細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)、上調(diào)細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá) 30、60、120 μmol/L Art組SGC-7901細(xì)胞中Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)水平分別為(435.79±7.10、397.76±10.28、362.76±8.74) 及(316.77±5.93、352.40±5.96、388.56±9.30)；對(duì)照組中Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)水平為(466.81±10.18、291.00±8.95)。青蒿琥酯組中Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而Bax蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。且具有Art劑量依賴性。

2.3Art下調(diào)SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位表達(dá)水平 30、60、120 μmol/L Art組SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位表達(dá)水平(489.34±3.49、473.19±3.01、442.54±4.59)顯著低于對(duì)照組(500.80±2.65)，(P<0.05)，且具有劑量依賴性。

2.4Art上調(diào)SGC-7901細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)水平 30、60、120 μmol/L Art組SGC-7901細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)水平(363.44±7.46、391.90±4.32、426.34±4.08)顯著高于對(duì)照組(335.82±8.16，P<0.05)，且具有劑量依賴性。

3 討 論

胃癌是發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤〔12〕，且病死率高〔13〕，手術(shù)、放療及化療等是胃癌的常規(guī)治療方法。胃癌發(fā)病過程隱匿，一般患者就診時(shí)已是中晚期，錯(cuò)過手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，化療就成為其主要的治療方法之一。影響化療效果的最主要因素包括，化療藥物的高毒副作用及化療藥物的多藥耐藥〔14〕。

本課題小組在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，Art具有抑制食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，并初步探究了其作用機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡有關(guān)。文獻(xiàn)顯示，Art對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用〔7〕，但目前在胃癌中的相關(guān)研究少有報(bào)道，且作用機(jī)制尚未闡明。

細(xì)胞凋亡調(diào)控的穩(wěn)態(tài)對(duì)于維持正常組織的功能具有重要意義，一旦平衡被打破，就會(huì)引起疾病發(fā)生，包括腫瘤的發(fā)生。腫瘤細(xì)胞在其發(fā)生及發(fā)展過程中，細(xì)胞凋亡機(jī)制往往被抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的旺盛增殖能力。鑒于凋亡與腫瘤發(fā)生有如此密切關(guān)系，目前開發(fā)新抗癌藥物時(shí)，將藥物能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作為判斷藥物是否有效的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)到青蒿琥酯干預(yù)SGC-7901細(xì)胞后，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，且隨著青蒿琥酯濃度的增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用越強(qiáng)。提示了青蒿琥酯具有誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡作用。這與本課題組以往研究的青蒿琥酯具有誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡作用〔15,16〕相一致。

線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)控制中心，是細(xì)胞凋亡重要調(diào)控中心。細(xì)胞線粒體的跨膜電位降低可以誘導(dǎo)細(xì)胞色素C等釋放，活化Caspase 蛋白酶家族，引起細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過程。Bcl-2可以穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜電位，防止線粒體膜電位的耗散，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。而Bax則可導(dǎo)致線粒體膜電位的耗散，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，Art可以降低細(xì)胞線粒體膜電位水平。同時(shí)也檢測(cè)到Art可以抑制SGC-7901細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax及Caspase-3蛋白的表達(dá)。提示，Art可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。