貴州苗藥刺梨調控SIRT1-TGFβ/Smads信號途徑延緩腎纖維化的機制

郭銀雪 葛平玉 馬娟 詹繼紅

(貴州中醫藥大學第一附屬醫院 1腎內科，貴州 貴陽 550001；2泌尿外科)

腎間質纖維化是所有慢性腎臟疾病(CKD)進行性發展的最終病理結果。全國多中心橫斷面研究顯示，我國成年人CKD的總患病率為10.8%〔1〕。而終末期腎衰竭發病率高、死亡率高，且花費大量醫療資源〔2〕。因此，探討腎間質纖維化的防治措施在臨床上有重要意義。研究顯示，應用抗氧化劑能夠減輕梗阻性腎損傷和腎間質纖維化〔3，4〕。刺梨是薔薇科植物，民間主要將其果實和根入藥。藥理研究發現，其具有抗氧化、抗癌、提高免疫功能及抗衰老等重要藥理作用〔5〕，在眾多的動物實驗及臨床研究中均具有重要應用。刺梨凍干粉飽含刺梨黃酮及維生素C，我們前期的臨床研究表明，刺梨凍干粉具有良好的抗腎纖維化效應〔6〕。本研究擬通過氧化應激指標觀察刺梨凍干粉對單側輸尿管結扎術(UUO)腎纖維化模型大鼠的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物 50只SPF級雄性SD大鼠，體重140～160 g，由上海西普爾一必凱實驗有限公司提供，合格證號：DA942C48-72F76A1E-466ABC83-FC6974。實驗大鼠分籠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，設備使用證號：SCXK(滬)2013-0016，飼養于溫度25℃，12 h光照、45%～55%濕度的環境中，自由飲水，普通飼料進食。大鼠納入實驗研究后均先給予為期1 w的適應性喂養。

1.2主要藥物及試劑 刺梨凍干粉〔購自國藥集團金刺梨(貴州)科技開發有限公司〕；氯沙坦鉀片(杭州默沙東制藥有限公司，批號：L037309)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。兔抗轉化生長因子(TGF)-β1多克隆抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology公司，TGF-βⅠ型受體(TGF-βRⅠ)多克隆抗體購于武漢博士德生物公司。

1.3動物造模、分組及給藥方法 將50只SD雄性大鼠，適應性喂養1 w后，按隨機數據取出分為假手術組10只和手術組40只，手術組行UUO。術后第2天，手術組隨機分為模型組、SIRT1激動劑組、刺梨中劑量組、氯沙坦鉀組，每組10只。于分組當天，所有大鼠參照馬氏定理設定干預劑量。氯沙坦組給予氯沙坦10 mg/(kg·d)，濃度為20%；刺梨中劑量組給予3 g/(kg·d)，濃度為3%；SIRT1激動劑組給予白藜蘆醇25 mg/d。模型組和假手術組均同時給予同等容積無菌生理鹽水灌胃。實驗大鼠均每天干預1次，連續干預14 d。灌胃14 d后處死大鼠。UUO模型〔7〕的建立，以2%的戊巴比妥鈉0.6～0.8 ml行腹腔注射，大鼠麻醉后取右側臥位充分暴露左側腎區，局部備皮、消毒，行左側恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左輸尿管，用4-0號絲線上下結扎兩處，然后從中剪斷輸尿管，分層縫合關閉腹腔。假手術組除不結扎和剪斷輸尿管外，其他均與手術組手術過程一致。

1.4相關指標的檢測及實驗方法

1.4.1腎組織的采集及制備 各組大鼠均于治療后第14天處死，迅速摘取梗阻側腎臟，予縱行切開，取一份于4%多聚甲醛中固定，做蘇木素-伊紅(HE)、Masson染色；一份組織放入凍存管，置于液氮中速凍后，于-80℃冰箱保存，用于腎組織MDA、SOD測定及腎組織TGF-β1及TGF-βR Ⅰ蛋白的表達。

1.4.2組織學觀察 石蠟組織切片行HE、Masson染色。HE染色觀察腎臟病理學改變。Masson染色半定量分析：隨機選取20個互不重疊高倍視野(×400)，計算腎間質藍色著色占全片范圍。

1.4.3MDA及SOD測定 用預冷的0.85%生理鹽水裂解腎組織，制成10%和1%勻漿。按試劑盒說明書操作步驟，分別測定腎組織MDA含量及總SOD活性。

1.4.4免疫組織化學方法檢測 TGF-β1及TGF-βRⅠ表達水平采用Envision System 二步法。石蠟包埋的切片常規脫蠟至水，3%過氧化氫(H2O2)的甲醇溶液，抗原熱修復，正常兔血清封閉后，分別滴加兔抗TGF-β1多克隆抗體(1∶200)和TGF-βRⅠ多克隆抗體(1∶200)孵育過夜。滴加二抗，最后顯微鏡下控制二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染。同時采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。結果評估：TGF-β1及TGF-βRⅠ的表達采用半定量分析，即隨機選取20個互不重疊的高倍視野(×400)，采用IPP軟件計算腎皮質陽性著色面積占一視野場面積的百分比。

1.4.5Western印跡檢測 腎臟組織加細胞裂解液勻漿破碎，將裂解物移至新的離心管中，取樣加入十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)混勻經相關處理后離心去除不溶性沉淀，再次取樣使用SDS-PAGE分離，樣品行電泳、轉膜、封閉，加入一抗，4℃封閉過夜，加入二抗，室溫下搖床上孵育1 h；顯影。用圖像分析軟件Gel-Pro Analyzer測定各組蛋白的相對光密度值和目的條帶及內參GAPDH條帶的灰度比值，分別表示各蛋白的表達水平。

1.4.6Real-time PCR法 液氮中取50 g腎組織加入500 μl RLA 冰上勻漿，12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清采用磁珠法RNA抽提試劑盒提取腎臟總RNA，核酸蛋白測定儀測定RNA純度及含量，取2 μl RNA進行逆轉錄，反應條件65℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min，合成cDNA，采用20 μl反應體系進行PCR 擴增，反應條件95℃ 30 s 預變性；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。引物合成根據已發表的基因庫及參考文獻設計，由上海里奇生物技術有限公司合成：GAPDH正義鏈：5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，反義鏈：5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT(113 bp)-3′；Smad 2正義鏈：5′-GCCGCCCGAAGGGTAGAT-3′，反義鏈：5′-TTCTGTTCTCCACCACCTGC(164 bp)-3′；Smad3正義鏈：5′-CGATGTCCCCAGCACACAATAAC-3′，反義鏈：5′-TAGTAGGAGATGGAGCACCAAAAGG(82 bp)-3′；Smad7正義鏈：5′-GGTGCGTGGTGGCATACT-3′，反義鏈：5′-GCTGACTCTTGTTGTCCGAAT(144 bp)-3′；TGF-βR1正義鏈：5′-GCAATGGGCTTAGTATTCTGG-3′，反義鏈：5′-AAGGCAACTGGTAGTCTTCGTG(76 bp)-3′；TGF-β1正義鏈：5′-CATGGAGCTGGTGAAACGGAAG-3′，反義鏈：5′-GACTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC(74 bp)-3′。

1.5統計學處理 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1腎臟的病理改變 肉眼觀，假手術組雙側腎臟顏色紅潤，中等大小，外有脂肪組織包裹，包膜完整；模型組右腎正常，左側梗阻腎腫脹，體積增大，呈囊狀，皮質較薄，色暗紅。光鏡下，經HE和Masson染色均顯示，UUO術后組織學表現為大量淋巴細胞、漿細胞浸潤和間質纖維化。腎小管可見蛋白管型、紅細胞管型或是萎縮；部分區域腎小管擴張，腎球囊周圍纖維化，部分腎小球發生玻璃樣變和纖維化。刺梨中劑量組、SIRT1激動劑組及氯沙坦鉀組纖維化程度較模型組減輕(P<0.05)。見圖1、2，表1。

2.2各組腎組織SOD、MDA含量比較 與假手術組相比，模型組、氯沙坦鉀組、SIRT1 激動劑組及刺梨中劑量組腎組織SOD表達顯著降低，MDA表達顯著升高(P<0.01)；氯沙坦鉀組、SIRT1 激動劑組及刺梨中劑量組差異無顯著性(P>0.05)，但與模型組均有顯著差異(P<0.01)。見表1。

2.3各組免疫組化TGF-β1及TGF-βRⅠ表達比較 模型組、氯沙坦鉀組、SIRT1激動劑組及刺梨中劑量組腎小管上皮細胞和間質TGF-β1及TGF-βRⅠ表達水平顯著高于假手術組(P<0.01)；而刺梨中劑量組、SIRT1激動劑組與氯沙坦鉀組差異無顯著性(P>0.05)，但均顯著低于模型組(P<0.01)。見表2和圖3、圖4。

圖1 各組腎臟組織結構改變(HE，×400)

圖2 各組腎臟組織結構改變(Masson，×400)

表1 各組膠原藍染面積與AIO面積之比及SOD、MDA水平比較

與假手術組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01；下表同

表2 各組TGF-β1及TGF-βRⅠ表達比較

圖3 各組TGF-β1免疫組化表達(×400)

圖4 各組TGF-βRⅠ免疫組化表達(×400)

2.4各組Smad2、Smad3、Smad7表達比較 模型組、氯沙坦鉀組、SIRT1 激動劑組及刺梨中劑量組Smad2、Smad3表達顯著高于假手術組， Smad7顯著低于假手術組(P<0.01)；氯沙坦鉀組、SIRT1 激動劑組及刺梨中劑量組差異無顯著性(P>0.05)，但與模型組均有顯著差異(P<0.01)。見表3，表4。

表3 各組Smad2、Smad3、Smad7 mRNA水平比較

表4 各組Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達比較

3 討 論

腎間質纖維化是多種腎臟疾病發展至終末期腎衰竭的共同通路〔8〕。TGF-β是介導腎小球硬化和腎間質纖維化關鍵的細胞因子。其作用包括趨化和活化炎性細胞，介導腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化及刺激細胞外基質蛋白的合成及降低基質金屬蛋白酶的活性和(或)增加蛋白酶抑制劑的合成來促進細胞外基質的沉積。系膜基質的大量積聚是引起腎小球硬化，導致腎病患者出現腎衰竭的重要病理基礎，TGF-β1可促進系膜基質的合成與沉積，進而加速腎小球硬化過程。Poncelet等〔9〕發現系膜細胞可表達Smad1、Smad2、Smad3、Smad4 和Smad7。

刺梨作為藥食兩用植物，具有較高的藥用價值。現代藥理學研究證實，刺梨中含有豐富的刺梨黃酮、刺梨多糖等多種活性物質，不僅可以延緩衰老，還可增強機體抵抗力、發揮抗炎、抗癌作用，且在腎纖維化患者中應用還可增強腎小管和腎小球上皮細胞的自我修復功能〔10〕。

本實驗研究顯示，應用Masson觀察腎臟膠原表達，模型組較治療組膠原著色面積明顯增高；說明刺梨凍干粉能減少腎臟膠原表達。應用刺梨凍干粉治療后，UUO大鼠腎組織SOD活性提高，MDA含量降低，提示刺梨凍干粉具有抗氧化應激作用。同樣免疫組化及Western印跡也顯示刺梨凍干粉與氯沙坦鉀具有同等抗氧化應激，抗腎纖維化的作用，而無毒副作用。

綜上，刺梨凍干粉可能是通過調節SOD、MDA活性，緩解氧化應激損傷，保護腎小管上皮細胞受損，達到有效改善腎臟纖維化。其機制可能是通過激活體內SIRT1從而活化Smda7以下調TGFβⅠ、TGF-βRⅠ及Smda2、Smda3的表達。