三種培養原代支氣管成纖維細胞方法的比較

余思源 溫冬梅 芮奎 顧延會 歐陽瑤

(遵義醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥一病區，貴州 遵義 563100)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種高發病率、高死亡率累及氣道和肺部的疾病，以氣流受限為特征的〔1〕，氣道重塑是其病理基礎，有關COPD氣道重塑機制仍未明確，也是目前 COPD治療的難點〔2，3〕。有學者研究發現COPD的氣道重塑主要發生在小支氣管和直徑小于2 mm的細支氣管中，因此，支氣管成纖維細胞的結構和功能對維持小氣道正常生理功能，在調控小氣道的氣體流量及氣體分布的功能中有重要作用〔4，5〕。COPD的氣道重塑，尤其是氣道纖維化，是病情持續進展和惡化的關鍵因素〔6〕。一方面，支氣管成纖維細胞可能在COPD氣道重塑機制的研究中發揮著重要的作用，另一方面原生代的支氣管成纖維細胞生物學特性尚未發生改變，可以更好地反映體內的生長特性，可以用來模擬體內環境〔7〕。因此為了從細胞學和分子生物學水平進一步闡明COPD氣道重塑的發生機制提供更可靠的體外細胞模型以滿足體外實驗研究，探索建立能夠大量快速、高效獲取原代支氣管成纖維細胞的方法具有重要的意義。本實驗采用Ⅰ型膠原酶和木瓜蛋白酶聯合消化法+組織塊黏附法、雙酶消化法+組織黏附法、組織塊黏附法分別分離大鼠支氣管成纖維細胞體外培養，并參考國內外技術方法進行改進和對比，建立大鼠支氣管成纖維細胞原代培養技術并鑒定細胞的純度，為分離具有較高存活率的支氣管成纖維細胞提供了良好的條件，同時也為構建COPD氣道重塑的體外模型奠定了堅實的基礎〔8，9〕。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性 Sprague-Dawley大鼠，體重150～180 g，購自第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心。動物使用許可證號：00024737。

1.1.2主要試劑 DMEM高糖培養基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，BI公司)Ⅰ型膠原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白均購自Sigma公司。0.25%胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、4%多聚甲醛溶液、山羊血清(封閉用)、4，6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI)、CCK8均購自Solarbio 公司。波形蛋白免疫熒光一抗、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗小鼠二抗購自BOSTER公司。細胞培養瓶、離心管、培養皿等均為NEST產品。

1.1.3主要儀器 二氧化碳(CO2)培養箱(Thermo 公司)，倒置顯微鏡(Olympus CKX41)，酶標儀(Thermo，Multiskan MK3)。

1.2取材 頸椎脫臼法處死大鼠，在盛有75%乙醇燒杯中將其浸泡10～15 min，用鑷子夾住鼠尾放入彎盤，噴灑酒精后將其放入超潔凈的工作臺，切開胸腔，充分暴露心肺組織。然后用鑷子夾住主支氣管，取出心肺組織，在含有雙抗的磷酸鹽緩沖液PBS中洗滌3～5次。沖洗至無血跡后棄去心臟組織，將漂洗干凈的肺組織置于含有雙抗的 PBS玻璃皿中。更換手術器械，用一把眼科彎鑷輕輕夾住主支氣管，沿著左右主支氣管的走行，輕輕剝離去除肺組織。待去除大部分肺組織后用兩把有齒彎平臺鑷子輕輕刮去支氣管外層的結締組織。用無菌眼科剪將組織剪至1～2 mm3大小。

1.3不同酶消化法+組織塊貼壁法

1.3.1膠原酶聯合消化液的配制 二硫蘇糖醇(DTT)：7 mg，BSA：100 mg，Ⅰ型膠原酶：426.5 mg，木瓜蛋白酶：10 mg溶于50 ml D-Hank平衡鹽緩沖液，混勻，0.22 μm濾膜過濾除菌，-20℃保存，方法參照文獻〔10〕。

1.3.2酶聯合消化+組織塊黏附法 將剪好的支氣管組織，大小為1～2 mm3，置于50 ml離心管中，再加入3～4 ml膠原酶聯合消化液。置于37℃、5% CO2的孵育箱中消化。取出觀察并每隔15 min震搖離心管，消化時間需30～40 min，待組織碎塊消化成透明絮狀物時，用 850 r/min 離心6 min，吸取沉淀物至裝有3 ml含有20% FBS高糖DMEM培養液的T25培養瓶中，在培養瓶中充分將沉淀物吹打混勻，置于37℃、5%CO2的孵育箱中培養。24 h后，有單個支氣管成纖維細胞已貼附于培養瓶壁，收集未附著的組織塊并將其貼壁于新的 T25 培養瓶中，在已經貼壁生長的細胞培養瓶中添加含20% FBS、三抗(10 000 IU/ml青霉素g鈉、10 000 μg/ml硫酸鏈霉素、25 μg/ml兩性霉素B)和1%L-谷氨酰胺的高糖DMEM培養液，置于 37℃、5% CO2培養箱中繼續培養，3～4 d后在倒置顯微鏡下觀察。

1.3.3雙酶消化法+組織黏附法 支氣管組織剪至大小為1～2 mm3，在50 ml離心管中加入0.25%胰蛋白酶4～5 ml，并在37℃、5%CO2的孵育箱中消化10 min，期間每隔5 min震搖1次；10 min后取出離心管，棄去上清液，重新加入新的0.25%胰酶4～5 ml，將其置于37℃、5%CO2的孵育箱中8 min，每隔4 min搖動1次，觀察組織是否有黏稠感，取出離心管加入3～4 mlⅠ型膠原酶，繼續在37℃、5%CO2的孵育箱中消化15 min，期間每隔8～10 min震搖 1次，消化30～40 min，觀察組織塊成為透明絮狀物時，用850 r/min離心6 min，吸取沉淀物至裝有3 ml含有20% FBS高糖DMEM培養液的T25培養瓶中，在培養瓶中充分將沉淀物吹打混勻，置于37℃、5%CO2的孵育箱中培養。24 h后用組織塊黏附法步驟同1.3.2。

1.4組織塊黏附法 將支氣管組織剪成1～2 mm3小塊，用彎曲的移液管將剪好的組織塊貼附固定在培養瓶底部。倒置培養瓶后加入3 ml含含20% FBS、三抗(10 000 IU/ml青霉素g鈉、10 000 μg/ml硫酸鏈霉素、25 μg/ml兩性霉素B)和1%L-谷氨酰胺的高糖DMEM培養液，置于37℃，5%CO2培養箱中孵育(注意：培養基不應接觸組織塊)，3～4 h后輕輕翻轉培養瓶，使組織塊完全浸入培養基中并靜置，盡量不要在前3 d轉動培養瓶，以確保細胞順利生長。4～5 d后在倒置顯微鏡下觀察。

1.5大鼠支氣管成纖維細胞傳代及純化

1.5.1支氣管成纖維細胞傳代 待細胞生長至70%～80%時，吸出培養基并用PBS洗滌細胞2～3次，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶消化液，在培養箱內消化2～3 min，取出培養瓶后置于鏡下觀察發現細胞體積變圓、成片收縮時，加入5～6 ml含10% FBS的培養液終止消化，并將細胞懸液放入10 ml離心管中850 r/min離心5 min，棄去上清液，重新添加新的培養液并重懸細胞，分裝到培養瓶，置于37℃，5%CO2敷箱中培養。第二天觀察傳代細胞的生長狀態和貼壁情況。每2～3 d換一次培養基，80%～90%匯合后傳代。

1.5.2差速貼壁法純化成纖維細胞 培養瓶里加入1 ml 0.25%胰蛋白酶，放入培養箱內放置2～3 min，取出培養瓶并將其置于顯微鏡下觀察發現細胞體積變圓、成片收縮時，通過加入5～6 ml 含10% FBS 的培養液終止消化，并將細胞懸液吸入到10 ml離心管中以850 r/min 離心5 min，棄去上清液，重新加入新的培養液吹散混勻細胞后分裝到培養瓶。在培養箱中放置15 min后保留黏附的氣道成纖維細胞并吸出培養液，加入新的培養液繼續在37℃，5%CO2敷箱中孵育〔11〕。重復以上步驟 2～3次，貼附的幾乎為成纖維細胞，細胞的形態學變化在鏡下觀察，并拍照記錄。

1.6成纖維細胞的熒光鑒定 細胞鑒定：取第三代的細胞，以5×104/ml密度計數細胞懸液并接種到6孔板中，置于37℃含5%CO2的細胞培養箱中直至細胞貼壁。取出6孔板，吸出培養基，加入4%多聚甲醛在室溫下固定30～40 min，0.3% Triton-X100 室溫透化破膜10 min；將山羊血清在室溫下封閉30 min，棄血清后滴加一抗波形蛋白，濃度為1∶100，4℃冰箱過夜。18～24 h后將6孔板從4℃冰箱中取出復溫20 min后棄一抗，避光條件下加入濃度為1∶100的FITC標記的羊抗小鼠抗體，室溫避光條件下靜置70 min，丟棄二抗，避光環境中加入DAPI，復染核10 min，上述操作過程每步用PBS漂洗3 min×3次，洗去DAPI后熒光顯微鏡下拍照〔12〕。

1.7成纖維細胞增殖曲線測定 取第3代細胞，以5×104/ml的密度計數細胞懸液接種到96孔板中，每孔為100 μl，置于37℃、5%CO2培養箱中至細胞貼壁后，予以無血清的DMEM培養液同步化24 h，隔天加入CCK8試劑10 μl/孔，37℃、5% CO2培養箱中孵育1 h，通過酶標儀檢測OD450 nm的值并連續檢測7 d，記錄并作圖。

2 結 果

2.1獲取支氣管組織 通過頸椎脫位處死大鼠，噴灑酒精后將其置于超凈工作臺，切開胸腔，充分暴露出心肺組織，取出心肺組織，最后獲取支氣管組織塊，見圖1。

圖1 獲取支氣管組織

2.2不同消化方法支氣管成纖維細胞的鏡下表現 酶消化法原代培養24 h換液后觀察到三角形或近似梭形的細胞黏附。在第3天幾乎所有細胞變成梭形，偶可見多邊形細胞。在第5天細胞的胞質伸展，單層融合，細胞形態呈長梭形，紡錘狀、胞質豐富，可見多數核分裂象，并聚集成團生長。第7天隨著成纖維細胞的融合，細胞快速生長，細胞匯合度可達90%，銜接緊密，胞體變得細長并呈線性、放射狀或柵欄狀起伏，一些區域可堆疊成多層生長。見圖2。

2.3組織塊黏附法的鏡下表現 在原代培養的第5天細胞黏附在壁上，細胞形態和大小各不相同，主要為多角形、不規則形，長梭形少見。7 d細胞變形為長紡錘形，但細胞數量較少。近14 d幾乎所有細胞為長梭形，有分支狀突起，豐富的胞質并且細胞平行排列成單層，成旋渦狀，放射狀或似柵欄狀起伏或出現多個區域的重疊層。可在14 d左右傳代。見圖3。

圖2 酶消化法培養的原代支氣管成纖維細胞(×200)

圖3 組織塊貼壁法培養的原代支氣管成纖維細胞(×200)

2.4支氣管成纖維細胞傳代培養 通過3種方法培養的細胞生長至70%～80%即可傳代，0.25%胰蛋白酶消化后，細胞呈單個半透亮的小圓點。在1 d后變為分散長梭形貼壁細胞，3～4 d后呈放射狀生長的成纖維細胞幾乎填充整個培養瓶。通過時差黏附法純化細胞，傳代至第 2 代，雜細胞基本除去，細胞形態均為長梭形。因此2～4代細胞活性狀態較好。

2.5鑒定支氣管成纖維細胞的純度 培養的第三代細胞行波形蛋白(Vimentin)特異性免疫熒光鑒定，經Vimentin免疫熒光細胞化學染色后，波形蛋白呈陽性表達Vimentin表達為陽性，而抗α-肌動蛋白(anti-α-SMA)染色呈陰性，培養的大鼠支氣管成纖細胞陽性率達95.0%以上。細胞純度高。見圖4。

圖4 第三代大鼠支氣管成纖維細胞免疫熒光鑒定(×200)

2.6大鼠支氣管成纖維細胞生長曲線 選取第3代支氣管成纖維細胞用CCK-8檢測細胞增殖活性，檢測OD450 nm值并繪制生長曲線。將OD450 nm平均值作為縱坐標，培養天數為橫坐標作圖。第1～2天為細胞的適應期，生長相對緩慢。第3～6天是細胞的對數生長期并且生長相對較快。第6天生長達到高峰，第7天細胞進入生長平臺期，細胞增殖減慢，活性下降。生長曲線近似于“S”形。見圖5。

圖5 第三代大鼠支氣管成纖維細胞生長曲線

3 討 論

方秋紅等〔3〕成功培養出人支氣管成纖維細胞并對其生物特性、功能與肺成纖維細胞做出了比較和區別，為COPD氣道重塑的體外研究奠定了基礎。支氣管成纖維細胞是參與氣道構成的主要細胞，對維護小氣道功能的穩定發揮著重要的作用。一方面支氣管成纖維細胞參與小氣道的形成，產生細胞外基質成分，例如Ⅰ、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白；另一方面，支氣管成纖維細胞還可以產生氣道重塑過程中所需的基質金屬蛋白酶、 各種生長因子和細胞因子〔14〕。氣道重塑的發生與發展可能與支氣管成纖維細胞的異常增殖和分泌功能障礙有關。原代細胞培養更能接近并反映了體內的生長特性，且動物取材相對人體取材更方便，因此體外培養大鼠支氣管成纖維細胞對COPD氣道重塑的體外研究很有必要，且提供了良好的實驗基礎〔15〕。本研究過程中，通過反復試驗和嘗試組織塊黏附法、改良后的Ⅰ型膠原酶聯合消化-組織塊黏附法以及胰蛋白酶+Ⅰ型膠原酶消化(雙酶法-貼壁組織塊法)，對各種培養方法進行反復調整、改良和對比，發現胰蛋白酶+Ⅰ型膠原酶消化+貼壁組織塊法(雙酶法-貼壁組織塊法)，操作簡便，實用，經濟，相比另外兩種方法得到的支氣管成纖維細胞數目最多且細胞活性最好。改良的特點有：①首先用0.25%胰蛋白酶消化10～15 min，目的是胰蛋白酶增強間質蛋白的消化，使細胞中的蛋白質完全水解，細胞分散更快；②其次在37℃，5%CO2的培養箱中用Ⅰ型膠原酶消化細胞。目的是進一步地松解纖維組織，消化膠原纖維，使支氣管成纖維細胞釋放出來，且膠原酶作用溫和，對細胞的損傷小。③酶消法后再繼續使殘留的組織塊重新貼壁培養是本實驗改良方法的關鍵。在傳統的酶消化方法之后，組織塊隨細胞被吹散消化后，組織塊僅使用一次，并且沒有選擇再生貼壁培養。酶消化后組織內的細胞變得松散，黏附更牢固，細胞更易游出，在縮短培養周期的同時，也提高了細胞產量，更加經濟實惠。

胰蛋白酶消化預處理可部分分解細胞外基質成分，使得組織塊疏松，細胞易于爬出生長；但因其酶解作用較強，可損傷細胞膜上的相應抗原及受體成分，影響細胞狀態，因此選擇合適的酶解濃度和時間至關重要。經過多次試驗，發現胰蛋白酶濃度為2.5 g/L，胰蛋白酶消化時間15～20 min的條件下細胞爬出速度及生長狀態最佳。未經胰蛋白酶預先消化時，成纖維細胞成簇爬出平均時間約為5 d，需7～9 d才能達到傳代狀態。在上述酶解條件下，細胞爬出平均時間提前，3～4 d，且組織塊周圍細胞爬出數量也明顯增多，5～7 d即可傳代，從而提高細胞的培養效率。本課題組也試驗了單純用胰蛋白酶消化法，發現其獲取支氣管成纖維細胞的效果不理想。分析失敗的原因為胰蛋白酶具有較強細胞毒性，細胞膜的破壞性也較大，因此對細胞的存活有負面影響〔16〕。

目前國內外關于SD大鼠支氣管成纖維培養的報道很少。組織塊黏附法、酶消化法是培養原代細胞的常用方法。組織塊黏附法培養細胞的優點是成本低、操作簡單〔17〕；但其培養周期長，根據本實驗的觀察，一般需要5～7 d 方有單細胞游出，10 d左右才能融合成片，獲得足夠數量的細胞至少需要12～15 d 。一方面組織長期持續浸漬在溫暖而又富有充足營養的培養基中為細菌和真菌的生長提供了溫床，易污染。另一方面培養液不易滲透組織，導致部分組織塊因缺乏營養而壞死變黑，壞死的組織產生的有害物質也可能對細胞的爬出產生不良影響。而且組織塊貼壁不易附著在培養瓶上，容易脫落。此外組織塊貼壁法的效率較低，爬出足夠數量的原代細胞通常要花費數星期時間〔18〕。這些問題使組織塊貼壁培養法不太適應于當前研究中對支氣管成纖維細胞大量需求的情況。因此，相比之下，酶消化法更為高效，同時細胞產量也得到提高、具有操作簡便快速、易掌握的優點，并使細胞污染的風險降低。酶消化法利用消化酶如膠原酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶的作用來破壞細胞結締組織之間的聯系，將上皮組織與結締組織分離，并且在化學反應后進一步消化間充質組織以產生成纖維細胞懸液，最終細胞接種后可獲得原代細胞。膠原酶消化法和胰蛋白酶消化法+膠原酶消化法是常規實驗中使用的兩種主要酶消化法〔19,20〕。

膠原酶能在生理pH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構，而不損傷其他蛋白質和組織，因此消化作用相對較溫和。膠原酶可分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型和專用肝細胞膠原酶。Ⅰ型和Ⅲ型膠原可在支氣管成纖維細胞中合成〔21〕。促進成纖維細胞釋放的關鍵酶是I型膠原酶，作用為使Ⅰ、Ⅲ型膠原得到充分水解。本研究利用I型膠原酶與木瓜蛋白酶聯合消化，并添加BSA及DTT 輔助消化，對細胞的損傷程度減輕，使組織內的細胞更容易釋放遷出并可高效快捷的獲得大量的細胞。細胞接種后活力好，生長增殖能力較強，生長時間短，細胞產量高〔22〕。木瓜蛋白酶降解膠原纖維并簡化蛋白質結構，使細胞更容易從組織中釋放出來。蛋白質中的半胱氨酸之間形成的蛋白質分子或分子間的二硫鍵被DTT阻斷，同時保護蛋白質中的半胱氨酸成分免受氧化，使蛋白變性發生的概率降低。BSA的加入可防止酶的分解和特異性的吸附，穩定酶的活性，防止酶失活〔10〕。在本研究中還觀察到，傳代次數的增加，細胞活力的降低，細胞形態的改變，主要表現為星形、三角形或扁平的多突紡錘形。原因可能是原代細胞本身的逐漸老化，隨后通過多次傳代導致細胞增殖能力減弱。多細胞分裂導致細胞逐漸喪失成纖維細胞的生長和分化特性，引起細胞表型的變化，從而可轉變為肌成纖維細胞〔23〕。因此不建議采用4代之后的支氣管成纖維細胞進行相關實驗研究。

存在于中間絲的Vimentin是成纖維細胞內便于鑒定的特異性蛋白質〔24〕。它存在并在中胚層起源的細胞中表達，是間質細胞中最主要的中間纖維，提供微管和肌動蛋白不具有的特定彈性，負責維持細胞骨架的完整性〔25〕，可以根據其陽性表達鑒定支氣管成纖維細胞的純度。氣道成纖維細胞在健康狀態下不表達α-SMA，但在氣道重塑過程中，α-SMA的表達被認為是成纖維細胞活化并分化為肌成纖維細胞的標志〔26〕。本研究免疫熒光鑒定中顯示anti-α-SMA染色呈陰性，說明本課題組成功分離、培養出支氣管成纖維細胞，且純度為95%以上。

綜上，改良胰蛋白酶+膠原酶聯合消化法+組織塊貼壁法能最大限度地利消化利用支氣管組織，獲得的原代支氣管成纖維細胞數量最多。此法操作快捷、簡便且不易污染，為COPD氣道重塑的體外研究提供大量種子細胞，從細胞分子水平研究COPD氣道重塑的發病機制和防治提供了體外實驗基礎。