CYP2R1基因多態性與恩替卡韋抗病毒治療乙型肝炎病毒e抗原血清學轉換的相關性

李鳳中 陳衛國 陳小林 (萍鄉市人民醫院 檢驗科，江西 萍鄉 337000；肝病科)

乙型肝炎病毒(HBV)感染仍為全世界重要的公共衛生問題，目前約超過 2.4 億人是HBV表面抗原(HBsAg)攜帶者。在 HBV 入侵人體并造成感染后，病毒、環境及宿主因素均可在進展為肝硬化、肝代謝異常甚至肝癌的過程中起重要作用〔1〕。近年來，宿主的基因多態性及免疫應答成為探索 HBV 感染后不同結局的熱點〔2〕。體內研究也證明，1，25二羥基維生素D〔1,25(OH)2D〕可增強宿主抵抗病毒的能力〔3〕。將維生素 D 及其類似物與抗病毒治療手段結合應用時，可顯著提高機體的免疫應答率，從而為抗病毒治療提供新的思路。CYP2R1基因位于染色體11p15.2上，含有5個外顯子，編碼維生素D25-羥化酶〔4〕。研究表明CYP2R1基因的單核苷酸的多態性(SNP)與人體內25(OH)2D水平顯著相關，位于該基因第2外顯子上的一個錯義突變可能會引起體內維生素D缺乏現象，并最終影響維生素D生物學效能的發揮，增加2型糖尿病(T2DM)的患病風險〔5〕。但是有關CYP2R1 多態性與HBV感染及對乙型病毒肝炎(CHB)抗病毒治療的關系研究還未見報道，因此有關 CYP2R1基因多態性與抗病毒治療CHB療效作用還需進一步研究。本研究選擇CYP2R1基因兩個 SNP位點作為候選位點進行基因分型分析，檢測其CYP2R1基因多態性及抗病毒治療療效進行研究。

1 材料與方法

1.1病例選擇 選取2016年6月至2017年12月萍鄉市人民醫院肝病門診及住院的CHB患者65例為研究對象，男38例，女27例，平均年齡(62.1±4.03)歲。納入標準：HBsAg呈陽性且已持續6個月以上；HBV DNA水平>1×105拷貝/ml；乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)陽性；乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)為陰性。排除標準：患有人免疫缺陷病毒(HIV)和丁型肝炎病毒(HDV)及丙型肝炎病毒(HCV)感染；有肝癌或肝癌病史,甲胎蛋白(AFP)>50 ng/ml;以往接受過核苷酸或核苷酸類藥物治療；既往5年內發生過其他系統腫瘤病史。

1.2治療方法 符合本研究入選標準的患者進行抗病毒治療，給予常規恩替卡韋治療，口服0.5 mg/d(南京正大天晴制藥有限公司，國藥準字H20120038)，治療48 w。患者臨床數據使用標準案例記錄表格收集。

1.3乙肝病毒學治療應答定義 在連續給予恩替卡韋治療48 w后，HBV DNA小于500拷貝/ml，持續維持HBV DNA低水平至隨訪結束的72 w，同時患者血清HBeAg由陽性轉為陰性，HBeAb為陽性且丙氨酸氨基轉移酶(ALT)值正常范圍內稱為完全應答(CR)，反之沒有發生血清HBeAg轉變，稱為非完全應答(NCR)。

1.4研究方法 給予CHB患者恩替卡韋治療后，分別在12、24、48、72 w進行病例隨訪，并完成下列指標的檢測：臨床生化指標：天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、ALT、 總膽紅素(TBiL)、總蛋白(TP)及白蛋白(ALB)，使用AU5400生化儀檢測(貝克曼公司)。HBV DNA檢測：HBV DNA指標的檢測由醫院PCR室按常規實驗室方法進行，引物及相關步驟方法均按照中山大學達安基因 (PCR-熒光探針法)檢測，嚴格遵照試劑盒說明書，貨號DA0031。CHB患者CYP2R1 rs2060793，rs12794714 基因分型檢測：人外周血全基因組DNA提取應用QIAGEN試劑盒，根據試劑盒的操作步驟，采用PCR方法來擴增目的基因。引物序列和PCR條件見表1。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行t及χ2檢驗。

表1 引物序列及反應條件

2 結 果

2.1兩組臨床特征比較 65例CHB患者在經過恩替卡韋抗病毒治療后，顯示CR為30例(CR組)，NCR為35例(NCR組)。兩組性別、治療前HBV DNA含量、AST及ALT水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

組別n男/女(n)年齡(歲)HBV DNA(log 10拷貝/ml)AST(U/L)ALT(U/L)CR組3018/1262.09±4.126.01±0.5334.59±3.3278.12±8.63NCR組3520/1562.55±2.975.95±0.4836.78±4.5280.74±7.71χ2或t/P值2.684/0.1020.852/0.2030.209/0.7040.642/0.4520.954/0.195

2.2CYP2R1基因SNP位點等位頻率及Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗 在對CHB患者進行基因分型后，分析CYP2R1各個位點的等位頻率，CYP2R1 rs2060793(-89T/T)和rs12794714 (-65T/C)次要等位基因頻率分別為36.20%和16.70%，基因型頻率的觀測值和H-W預期值之間差異無統計學意義(χ2=2.516,P=0.125;χ2=2.049,P=0.107)，表明本研究中所選群體研究對象有代表性，達到遺傳平衡定律。

2.3CYP2R1 rs2060793 和rs12794714 SNP位點基因分型與抗病毒治療后HBeAg血清學轉換關聯分析 CR組rs12794714位點T等位基因頻率明顯高于NCR組，差異有統計學意義(χ2=4.07,P=0.035)。與C等位基因相比，T等位基因發生血清HbeAg轉換的比值比OR為2.019(0.982～4.319)。TT和TC合并分析發現，攜帶TT基因型的患者在經過恩替卡韋治療后，更容易實現血清轉換，抗病毒應答效果更明顯。而對于CYP2R1 rs 2060793位點，T等位基因頻率在兩組分布與TT基因型在兩組分布頻率差異均無統計學意義(P>0.05)。 見表3。

2.4CYP2R1 rs12794714基因型與恩替卡韋治療后CHB患者HBV DNA含量關聯分析 攜帶CYP2R1 rs12794714 TT基因型的患者在恩替卡韋在用藥后第12 w、24 w、48 w及72 w隨訪HBV DNA含量低于非TT基因型的患者，其中第24、48、72周兩組差異有統計意義(P<0.05)，見表4。

表3 CYP2R1 SNP位點分型與血清學HBeAg轉換的關聯性分析 (n)

基因型n治療前第12周第24周第48周第72周非TT型246.09±0.855.59±0.604.08±0.423.39±0.333.09±0.25TT型415.85±0.785.05±0.463.04±0.302.10±0.272.01±0.18t值1.3251.9852.6043.2683.351P值0.1030.0980.0360.0150.014

3 討 論

HBV入侵機體后，造成肝臟組織慢性炎癥感染，病毒因素、環境因素及宿主本身因素均在此過程中起重要作用〔6〕。目前關于患者維生素D含量減少對許多慢性肝病病情發生的影響已經有報道〔7〕。研究發現補充維生素D與抗病毒治療手段聯合應用時，可顯著提高CHB機體的免疫應答率，說明維生素D在抗乙肝病毒治療中有著重要的功能〔8〕。機體25(OH)D3的含量與其代謝酶的關系密切，25(OH)D3由維生素D3前體在肝細胞內經25-羥化作用合成，主要由CYP2R1酶催化〔9〕。研究表明CYP2R1基因的SNP與人體內25(OH)D水平顯著相關，位于該基因第2外顯子上的一個錯義突變可能會引起體內維生素D缺乏現象，并最終影響維生素D生物學效能的發揮，增加T2DM的患病風險〔10〕。Barooah等〔11〕發現CYP2R1基因rs10741657位點變異與人體內25羥基維生素D3水平顯著相關，GG基因型攜帶者體內25羥基維生素D3水平是AA基因型攜帶者的1/2〔3〕。

CHB患者在臨床治療中要獲得較好的療效，一般要經歷3個過程：HBV DNA的病毒載量水平較低；HBeAg發生血清學轉換；實現血清學轉換〔12〕。CR患者血清學轉換成功說明宿主的主動免疫功能恢復。本研究結果說明CYP2R1基因多態性在恩替卡韋治療后病毒學應答有相關聯，TT型可以預測CHB患者在使用恩替卡韋的治療效果。一些研究已提出通過檢測宿主維生素D相關基因來預測對恩替卡韋治療的反應〔13〕。最近研究表明CHB患者低血清維生素D水平與高水平的HBV復制和不良臨床結果相關，包括肝硬化并發癥及肝癌〔14〕。CYP2R1 rs12794714 TT基因型可預測恩替卡韋治療后持續的HBeAg血清轉換。本文結果與Zhang等〔15〕研究結論一致，該研究發現CYP2R1的rs12794714 SNP與中國東北地區兒童的血清25(OH)D3顯著相關。

總之，CYP2R1 rs12794714基因多態性與CHB患者的HBV復制有關，可預測HBeAg陽性CHB患者對恩替卡韋治療的抗病毒應答效果。但是本研究有局限性，如沒有評估基線血清25(OH)D3水平的影響，因為它受到幾個潛在的混雜變量影響，包括暴露于紫外線陽光，吸收不良，維生素的膳食攝入減少等原因。