三穗鴨ATF4基因多態性鑒定及其與蛋殼品質的關聯分析

譚光輝 李杰章 覃媛鈺 吳磊 張依裕

摘要：【目的】探討三穗鴨轉錄激活子4基因（ATF4）多態性與蛋殼品質的相關性，揭示禽類ATF4的生物學功能及其遺傳特性，為進一步研究蛋殼品質的調控機制打下基礎。【方法】以三穗鴨為研究對象，經PCR擴增獲得ATF4基因后采用直接測序法檢查三穗鴨ATF4基因全部編碼區的變異位點，運用SHEsis計算基因型頻率、等位基因頻率、單倍型頻率及基因型分布卡方值（c2）等，利用PopGen32計算各SNP位點的觀察雜合度（He）、有效等位基因（Ne）及多態信息量（PIC），并以SPSS 18.0中的一般線性模型（GLM）分析SNP位點對蛋殼品質的遺傳效應。【結果】在三穗鴨ATF4基因第3外顯子（Exon-3）上發現3個SNPs位點（g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G），均屬于同義突變。3個SNPs位點在三穗鴨群體中均呈中度多態性（0.25G位點對三穗鴨蛋重和蛋殼重的影響達顯著水平（P<0.05，下同），g.2667A>G位點對蛋殼厚度的影響達顯著水平，g.2394G>A位點對蛋殼品質性狀指標的影響不顯著（P>0.05）;雙倍型H2H2（AAGGGG）的蛋殼厚度、蛋殼強度和蛋形指數均最高，是對三穗鴨蛋殼品質最有利的基因型，且3個SNPs位點共同對蛋殼品質的影響效應明顯大于單個SNP位點。【結論】三穗鴨ATF4基因存在3個SNPs位點（g.2394G>A、g.2571 A>G和g.2667A>G），均屬于同義突變，其中g.2571A>G和g.2667A>G位點對蛋殼品質有顯著影響，3個SNPs位點組合基因型對蛋殼品質也產生顯著影響，可作為鴨蛋蛋殼品質選擇的分子遺傳標記。

關鍵詞： 三穗鴨;ATF4基因;SNP位點;多態性;蛋殼品質

0 引言

【研究意義】蛋殼作為禽蛋天然保護殼，在其保存、運輸及孵化等方面發揮著重要作用;高質量蛋殼不僅能延長禽蛋的保質期，減少運輸中的破損率，還能調節胚胎發育過程中的氣體交換，并為胚胎的生長提供鈣源，而有利于幼禽孵化（俞路等，2008;宋凌子，2019）。隨著畜禽養殖規模的不斷擴大，禽蛋的生產及銷售已形成巨大產業鏈，而蛋殼破損帶來的經濟損失也日益突出。因此，有效提高蛋殼品質，減少蛋殼破損，已成為家禽育種研究的重要內容之一。【前人研究進展】蛋殼在蛋殼腺形成過程中需要大量的鈣離子沉積（宋凌子，2019）。轉錄激活子4（Activating transcription factor 4，ATF4）最初被認為是一種廣泛表達的哺乳動物DNA結合蛋白，又稱為環腺苷酸連接效應元件2（cAMP-response element binding protein 2，cREB2），在各種應激信號誘導反應中發揮重要作用，也是內質網膜上細胞內鈣離子釋放的基本調控因子，對機體內鈣離子的沉積具有調控作用（Rzymski et al.，2009;St-Arnaud and Mandic，2010;Singleton and Harris，2012;王慧和劉勤江，2018;Tesei et al.，2019）。ATF4基因是鴨蛋蛋殼品質調控候選基因IP3R2的下游基因，其生物功能的發揮需要鈣離子活化激活，同時又是鈣離子釋放的基本調控因子之一（Sun et al.，2015），位于第1號染色體上，其mRNA全長1065 bp，DNA序列全長2914 bp，含3個外顯子和2個內含子。Chen等（2011）研究揭示，ATF4基因多態性與豬臀部脂肪厚度（BFT）、腰眼高度（LEH）、腰眼面積（LEA）及骨骼發育顯著相關。Voloshanenko等（2018）研究發現，結腸癌細胞的生長和增殖依賴于b-連環蛋白及獨立的Wnt信號傳導途徑，在Wnt信息傳導路徑中ATF4和ATF2能調控多種目標基因表達。此外，ATF4和ATF2基因沉默會降低靶基因原膠原賴氨酸-2-酮戊二-5-雙加氧酶（Recombinant procollagen lysine-2-oxoglutarate-5-dioxygenase，PLOD2）和配體依賴的輔阻遏物（Ligand-dependent corepressor，LCOR）表達，推測ATF4基因涉及Wnt信號傳導，而對癌細胞的生長和增殖有一定影響（De，2011;Ackers and Malgor，2018）。此外，ATF4基因在動物的眼部和骨骼發育等方面發揮重要作用。Ameri和Harris（2008）研究表明，若缺失ATF4基因，小鼠則表現出盲眼、貧血及鈣離子分泌不足造成骨骼發育不良等癥狀。Rzymski等（2009）、Saito等（2011）研究發現，在成骨細胞的分化進程中，PERK-Eif2a-ATF4信號路徑能誘導成骨必需基因的表達，如骨鈣素基因。綜上所述，ATF4能調節機體細胞內鈣離子的釋放，影響細胞的凋亡與增殖，而直接或間接影響生物體表型性狀。【本研究切入點】近年來，有關ATF4生物學功能的研究主要集中在人類和小鼠上（秦蜀等，2018;張晟等，2019;Xin et al.，2019），而鮮見針對禽類ATF4的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以三穗鴨為研究對象，探討ATF4基因多態性與其蛋殼品質的相關性，揭示禽類ATF4的生物學功能及其遺傳特性，為進一步研究蛋殼品質的調控機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

用于檢測ATF4基因多態性的288羽三穗鴨樣本來自貴州大學動物科學學院農場，45周齡，健康無病，且均采取單體籠飼養的管理方式。采用無抗凝劑的普通生化管對每羽三穗鴨翅靜脈采血1.0～1.5 mL，采血管編號與其翅號一致，靜置斜放待血清析出后用移液槍將血清轉移至離心管中，離心至樣品清澈透亮，-20 ℃保存備用。逐一收集記錄產蛋情況并編號（與翅號一致），進行蛋殼品質測定。全血DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，2×Taq PCR MasterMix試劑和瓊脂糖購自北京康為世紀生物科技有限公司，DM2000 DNA Marker購自重慶擎科生物科技有限公司。主要儀器設備：DYY-2C電泳儀（北京六一生物科技有限公司），PTC200梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司），BL-320H電子天平（日本島津公司），EFR-01蛋殼強度測定儀（北京天翔飛域儀器設備有限公司），EA-01蛋品質分析儀（北京天翔飛域儀器設備有限公司），HRLM-80高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 按照動物全血DNA提取試劑盒說明抽提血清基因組DNA，DNA編號對應三穗鴨翅號，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳結合核酸濃度測定儀進行檢測，稀釋至終濃度100 ng/mL，備用。

1. 2. 2 引物設計與合成 根據GenBank已公布的鴨ATF4基因序列（登錄號NC_040046.1），以Primer 3.0（http：//primer3.ut.ee/）設計擴增ATF4基因所有編碼區的5對引物（表1），所有引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 3 DNA池PCR擴增及測序分型 PCR反應體系20.0 mL：PCR MasterMix 8.0 mL，正、反向引物各1.0 mL，DNA模板1.0 mL，RNase-Free Water 9.0 mL。擴增程序：95 ℃預變性6 min;94 ℃ 30 s，退火50 s，72 ℃ 45 s，進行35個循環;72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并以MegAlign篩選單核苷酸多態性（SNP）位點。根據SNP位點，以個體DNA為模板，選用相應引物進行PCR擴增，擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，并進行基因分型。

1. 3 數據處理

運用SHEsis（http：//analysis.bio-x.cn/）計算基因型頻率、等位基因頻率、單倍型頻率、基因型分布卡方值（c2）和連鎖不平衡的D和g2，采用PopGen32計算各SNP位點的觀察雜合度（He）、有效等位基因（Ne）及多態信息量（PIC），并利用SPSS 18.0中的一般線性模型（GLM）分析SNP位點基因型和雙倍型與蛋殼品質性狀指標的相關性。

2 結果與分析

2. 1 三穗鴨ATF4基因多態性分析結果

使用MegAlign對三穗鴨ATF4基因多態性進行分析，結果在鴨ATF4基因第3外顯子（Exon-3）上共發現3個SNPs位點，且每個SNP位點均存在3種基因型，如圖2所示。3個SNPs位點分別是：g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G。進一步分析發現，3個SNPs位點均屬于同義突變，未引起編碼氨基酸變化。

2. 2 三穗鴨ATF4基因群體遺傳學分析結果

對三穗鴨ATF4基因檢測到的3個SNPs位點進行遺傳特性分析，結果（表2）表明，g.2571A>G位點以GA基因型為優勢基因型，其基因型頻率為0.479，以G為優勢等位基因，其頻率為0.573;該SNP位點在三穗鴨群體中的He為0.489。g.2667A>G位點以AA基因型為優勢基因型，其基因型頻率為0.469，以A為優勢等位基因，其頻率為0.672;該SNP位點在三穗鴨群體中的He為0.441。g.2394G>A位點以GG基因型為優勢基因型，其基因型頻率為0.458，以G為優勢等位基因，其頻率為0.682;該SNP位點在三穗鴨群體中的He為0.434。3個SNPs位點在三穗鴨群體中均呈中度多態性（0.25

2. 3 三穗鴨ATF4基因SNP位點的連鎖不平衡分析結果

D和g2是常用于衡量連鎖不平衡的2個重要參數，其中，區域內重組事件發生連鎖不平衡的概率通過D反映，而連鎖分析通過g2反映（Mayo，2008）。當D>0.8時，表明SNP位點間強連鎖且不平衡，當g2>0.330時，表明SNP位點間緊密連鎖且趨向于一個整體遺傳（Ardlie et al.，2002;Slatkin，2008）。由表3可知，g.2667A>G位點與g.2571A>G位點間的D為1.0，大于0.8，且g2為0.665，大于0.330，可確定這2個位點間處于強連鎖不平衡狀態，即g.2667A>G位點和g.2571A>G位點為高度連鎖，趨向整體遺傳;g.2394G>A位點與g.2571A>G位點間的D為1.0，大于0.8，且g2為0.347，大于0.330，可確定這2個位點間存在強連鎖不平衡狀態;g.2667A>G位點與g.2394G>A位點間的D為1.0，大于0.8，但g2為0.227，小于0.330，說明這2個位點間不存在強連鎖不平衡。

2. 4 三穗鴨ATF4基因SNP位點的單倍型和雙倍型分析結果

三穗鴨ATF4基因SNP位點的單倍型和雙倍型分析結果如表4所示，3個SNPs位點在三穗鴨群體中共檢測到4種單倍型（H1、H2、H3和H4）和9種雙倍型（H1H2、H1H3、H1H4、H2H2、H2H3、H2H4、H3H3、H3H4和H4H4）。其中，H2（AGG）為優勢單倍型，其頻率為0.328，H1（AAG）為劣勢單倍型，其頻率為0.099;H2H3（GAGAGA）為優勢雙倍型，其頻率為0.219，H1H2（AAGAGG）和H1H3（GAAAGG）為劣勢雙倍型，其頻率均為0.063。

2. 5 三穗鴨ATF4基因SNP位點基因型與蛋殼品質的關聯分析結果

三穗鴨ATF4基因3個SNPs位點基因型與蛋殼品質的關聯分析結果（表5）表明，g.2571A>G位點不同基因型個體間的蛋重和蛋殼重存在一定差異，以GA基因型個體的蛋重和蛋殼重最高，其次是GG基因型個體，AA基因型個體的最低，GA基因型個體的蛋重和蛋殼重均顯著高于AA基因型個體（P<0.05，下同）;g.2667A>G位點不同基因型個體間的蛋殼厚度存在一定差異，GG基因型個體的蛋殼最厚，AA基因型個體的蛋殼最薄，二者差異顯著;g.2394G>A位點不同基因型個體間的蛋殼品質未存在顯著差異（P>0.05，下同）。

2. 6 三穗鴨ATF4基因SNP位點雙倍型與蛋殼品質的關聯分析結果

三穗鴨ATF4基因雙倍型與蛋殼品質的關聯分析結果（表6）表明，H2H2個體的蛋殼厚度顯著高于H1H4個體和H4H4個體，H2H2個體和H3H4個體的蛋殼強度顯著高于H3H3個體，H2H2個體的蛋形指數顯著高于H4H4個體，H4H4個體的蛋重顯著高于H1H2個體和H2H2個體，H4H4個體的蛋殼重顯著高于H3H3個體，其他雙倍型與蛋殼指標間未產生顯著影響。

3 討論

近年來，有關ATF4基因多態性的研究主要集中在人類和動物上（Qu et al.，2010;Morris et al.，2014）。本研究在貴州地方品種三穗鴨ATF4基因的Exon-3上檢測到3個SNPs位點：g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G，均屬于同義突變，且這3個SNPs位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。Hardy-Weinberg平衡常用于預測未來世代的基因型和等位基因頻率，評估當前種群的平衡狀態，在一個大孟德爾群體中的個體間進行隨機交配，同時不存在選擇、突變、遷移和遺傳漂變發生時，其基因頻率將保持不變，即這個群體被稱為處于Hardy-Weinberg平衡（Mayo，2008）。由此推測，本研究中的3個SNPs位點尚未受到突變、選擇及遺傳漂變等的影響。畜禽基因組功能結構基因的變異可能會影響其生產性狀，而變異位點間的連鎖關系則決定群體遺傳結構的變化。本研究通過3個SNPs位點的連鎖不平衡分析，結果發現g.2667A>G位點和g.2394G>A位點間不存在強連鎖不平衡，說明這2個SNPs位點間趨向獨立遺傳，而其他SNP位點間均處于強連鎖不平衡狀態;此外，3個SNPs位點在三穗鴨群體中共檢測到4種單倍型（H1、H2、H3和H4）和9種雙倍型（H1H2、H1H3、H1H4、H2H2、H2H3、H2H4、H3H3、H3H4和H4H4），但理論上應該有8種單倍型和36種雙倍型，實際觀測值與理論值存在差異，可能是長期人工選育致使其他單倍型個體消失，也可能與本研究選擇的三穗鴨群體數量較少有關。由于3個SNPs位點均處于中度多態性，更有利于遺傳選擇（陳祥等，2017;李青等，2019），可在今后的遺傳選育工作中獲得更高的遺傳潛力;且3個SNPs位點的He相近，表明三穗鴨群體具有較高的遺傳質量（張躍博等，2018），但更精確的遺傳多樣性評價可能需要更多的樣本數量來支持。

本研究的關聯分析結果顯示，g.2571A>G位點對蛋殼品質產生明顯影響，GA基因型個體和GG基因型個體的蛋重分別比AA基因型個體重2.569和2.105 g，其差異均達顯著水平，且GA基因型個體的蛋殼重顯著高于AA基因型個體;g.2667A>G位點對蛋殼厚度產生明顯影響，GG基因型個體的蛋殼厚度顯著高于AA基因型個體;g.2394G>A位點不同基因型與蛋殼品質性狀間的相關性尚未達顯著水平。綜合各蛋殼品質性狀指標與不同基因型間的相關性，可初步確定GG基因型是對蛋殼品質有利的基因型。單個核苷酸堿基突變可引起蛋白構象變化，增加或降低熵值，影響基因復制速度、轉錄剪接過程及蛋白翻譯速度，甚至影響其半衰期，即通過調控基因表達水平進而影響畜禽生產性能（Gahlon et al.，2018）。g.2571A>G位點和g.2667A>G位點與蛋殼品質存在顯著相關性，推測其原因是A→G突變影響ATF4基因剪接的外顯子基序（Moura et al.，2011;Sauan and Kimchi-Sarfaty，2011;Supek et al.，2014），而基因剪接是基因表達中最重要的過程，直接影響ATF4基因編碼蛋白翻譯及蛋白功能、構象和表達水平的變化，進而影響機體鈣離子表達及引起機體調控蛋殼形成相關組織細胞的增殖和凋亡，間接或直接對蛋殼品質產生影響。

動物表型除受單個核苷酸堿基突變影響外，多個SNPs位點的組合效應也對其表型產生明顯影響。將多個SNPs位點進行組合產生的基因型分析能同步考慮非等位基因的相互作用及突變位點間的連鎖不平衡，具有更好的統計效力（Orozco et al.，2009）。本研究的SNP位點雙倍型與蛋殼品質關聯分析結果表明，3個SNPs位點聯合組成的雙倍型對蛋殼品質性狀指標有不同程度的影響，H2H2個體的蛋殼厚度、蛋殼強度和蛋形指數均最高，綜合各項蛋殼品質性狀指標在不同雙倍型個體間的差異，認為H2H2（AAGGGG）雙倍型是對三穗鴨蛋殼品質最有利的基因型，且3個SNPs位點共同對蛋殼品質的影響效應明顯大于單個SNP位點，說明3個SNPs位點共同聯合引起基因結構變化強于單個SNP位點，其對蛋殼品質的調控作用可能更有效。但由于部分雙倍型個體數量相對較少，其統計分析結果尚需進一步增加測試樣本以確定研究結論。

4 結論

三穗鴨ATF4基因存在3個SNPs位點（g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G），均屬于同義突變，其中g.2571A>G和g.2667A>G位點對蛋殼品質有顯著影響，3個SNPs位點組合基因型對蛋殼品質也產生顯著影響，可作為鴨蛋蛋殼品質選擇的分子遺傳標記。

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（責任編輯 蘭宗寶）