云南三七根腐病病原細(xì)菌的鑒定

張晉豪 楊俊 姬廣海 王彥芳 張榮琴 代真林 劉棋 魏蘭芳

摘要：【目的】明確云南三七根腐病致病細(xì)菌的種屬，為三七根腐病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。【方法】從云南省不同三七種植區(qū)采集三七根腐病植株，采用組織分離法進(jìn)行病原細(xì)菌分離，通過柯赫氏法則驗證病原菌的致病性，利用形態(tài)學(xué)、生理生化與基因序列分析相結(jié)合的方法明確病原細(xì)菌的分類學(xué)地位。【結(jié)果】采用組織分離法從發(fā)生三七根腐病的塊根中共分離到200多株細(xì)菌，經(jīng)室內(nèi)組培離體篩選得到10株細(xì)菌能引起三七塊根腐爛，其中1株細(xì)菌MA9對健康三七切傷組織的致病力最強，選取該株細(xì)菌進(jìn)行后續(xù)研究。健康三七塊根離體接種MA9菌液9 d后出現(xiàn)菌膿，塊根開始腐爛變黑、變軟，并伴隨有惡臭味。將MA9菌株搖瓶發(fā)酵制備成OD600約0.5的菌懸液灌根接種到溫室和田間健康三七植株上，均表現(xiàn)出與田間病株一致的癥狀：最初在蘆頭與芽基結(jié)合處出現(xiàn)褐色水漬狀病變，隨著病變不斷擴(kuò)展最終導(dǎo)致三七地下塊根頂芽腐爛和地上部植株死亡。在田間接種后發(fā)病的三七塊根重新分離到該病原細(xì)菌。利用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)和16S rDNA序列比對結(jié)果均顯示MA9菌株與產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indoloqenes）為同一種屬。【結(jié)論】引起云南三七根腐病的致病細(xì)菌為產(chǎn)吲哚金黃桿菌。這是國內(nèi)首次報道該菌能引起三七根腐病。

關(guān)鍵詞： 三七根腐病;產(chǎn)吲哚金黃桿菌;病原細(xì)菌鑒定;云南省

0 引言

【研究意義】三七[Panax notoginseng（Burk.） F.H. Chen]屬五加科人參屬多年生植物，是我國特有珍貴中藥材，也是云南省重要的生物資源（宮崢嶸，2014）。因三七生長環(huán)境獨特且生長周期較長，易誘發(fā)各種病害，其中以根腐病最嚴(yán)重（王勇等，2003）。連年種植三七會加重根腐病的發(fā)病率，根腐病常年造成三七損失5%～20%，嚴(yán)重者在70%以上，甚至導(dǎo)致絕收（馮光泉等，2003）。目前三七根腐病已成為云南三七產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，嚴(yán)重制約三七品質(zhì)和產(chǎn)量的提升。因此，明確引起三七根腐病的有害細(xì)菌，并針對病原靶標(biāo)進(jìn)行對癥防治，對促進(jìn)云南三七產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前對三七根腐病病原菌鑒定的研究較多，大多數(shù)報道三七根腐病是由病原真菌侵染引起。20世紀(jì)50年代最早記載三七根腐病病原菌為藤草鐮孢（Fusarium scirpi）（蔣妮等，2011）;繆作清等（2006）報道引起三七根腐病的病原真菌類群主要包括毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）、黃腐柱孢菌（C. didynum）、腐皮鐮刀菌（F. solani）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、惡疫霉（Phytophthora cactorum）、草莖點霉（Phoma herbarum）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）;毛忠順等（2013）報道三七根腐病病原是一種莖線蟲（Ditylenchus sp.）;汪靜等（2015）報道引起三七根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、茄病鐮刀菌（F. solani）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）;Mi等（2017）報道土赤殼屬（Ilyonectria mors-panacis）能引起三七銹腐病;董鮮等（2018）報道尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）為三七根腐病的重要致病菌，該菌可影響三七植株生長、光合作用及水分利用。近年來，還出現(xiàn)關(guān)于人參屬根腐病病原細(xì)菌的報道。Lei等（2017）報道假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）與鐮刀菌屬（Fusarium sp.）、絲核菌屬（Rhizoctonia sp.）的復(fù)合侵染會加劇三七根腐病發(fā)生;Li和Han（2017）首次報道普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）可引起人參屬根腐病;李紀(jì)潮等（2019）報道三七根腐病3種變形門致病細(xì)菌假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）、無色桿菌（Achromobacter marplatensis）和產(chǎn)堿菌屬（Candidimonas sp.）。【本研究切入點】目前，有關(guān)人參屬根腐病病原細(xì)菌的報道較少，關(guān)于金黃桿菌屬細(xì)菌能侵染三七植株引發(fā)根腐病的研究尚無文獻(xiàn)報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】對云南省三七根腐病病根組織進(jìn)行病原細(xì)菌分離培養(yǎng)和致病性測定，并采用形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)等方法明確其致病細(xì)菌的分類地位，以期為三七根腐病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 樣品采集 樣品采自云南省文山州、曲靖市、紅河州和昆明市等三七種植地。將發(fā)生根腐病植株的腐爛塊根置于采樣袋中，帶回實驗室進(jìn)行病原細(xì)菌的分離培養(yǎng)。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：葡萄糖/蔗糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、牛肉浸膏3.0 g、酵母浸膏1.0 g、瓊脂20.0 g，pH 7.0，蒸餾水1000 mL;KB培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、K2HPO4 1.5 g、瓊脂17.0～21.0 g、甘油10 mL，pH 7.0，蒸餾水1000 mL;LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化鈉10.0 g，pH 7.0，ddH2O 1000 mL;Bug瓊脂培養(yǎng)基（美國Biolog公司）。

1. 2 樣品的分離和純化

采用組織分離法進(jìn)行病原細(xì)菌分離（Dong et al.，2016）：取病健交界處病組織（切成5 mm×5 mm小塊），用75%乙醇溶液表面消毒1 min，無菌水沖洗3次后用滅菌吸水紙吸干水分，將病組織切下的小塊研磨搗碎后加入裝有45 mL無菌水的100 mL三角瓶中，26 ℃下160 r/min搖床振蕩20 min后取出靜置5 min，通過梯度稀釋成10-1～10-5，在NA、KB和LB固體培養(yǎng)基上依次按低濃度向高濃度進(jìn)行涂布，28 ℃恒溫培養(yǎng)。

1. 3 病原菌致病性篩選及測定

1. 3. 1 室內(nèi)組培離體篩選 將保存的菌株在NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3代。刮取菌落于NA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液濃度為OD600≈0.5（約3.0×108 CFU/mL），菌液稀釋20倍接種于健康三七塊根切口（位于三七塊根靠近蘆頭的1/5處），每株菌株進(jìn)行3次重復(fù)致病性篩選。以健康三七塊根切口接無菌水為對照。接種完成后于28 ℃恒溫培養(yǎng)，接種9 d后統(tǒng)一記錄各菌株對健康三七塊根的危害程度，進(jìn)行病原細(xì)菌初步篩選。

1. 3. 2 溫室灌菌致病性驗證 取室內(nèi)離體切傷初篩的細(xì)菌，菌懸液稀釋10倍后制成100 mL菌懸液，采用灌根法澆灌于健康三七根部，無菌水作對照，每處理3次重復(fù)。接種50 d后統(tǒng)計塊根腐爛程度。

1. 3. 3 高光環(huán)保型標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)施蔭棚三七致病性驗證 基于室內(nèi)離體切傷和溫室移栽灌菌兩次篩選后的細(xì)菌，再進(jìn)行田間灌菌驗證試驗。試驗在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)大河橋三七種植基地高光環(huán)保型標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)施蔭棚內(nèi)進(jìn)行，驗證方法同1.3.2，采用灌根接種法將菌懸液進(jìn)行澆灌接種，每隔15 d接種一次，每處理接種30株，每處理3次重復(fù)。接種60 d后取樣調(diào)查。

1. 4 病原菌生理生化鑒定

病原菌生理生化鑒定采用MicrostationTM V4.01系統(tǒng)（美國Biolog公司）。將供試菌株的單菌落劃十字接種在Bug培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h;用接種液配制成細(xì)菌懸浮液（濁度儀測定菌懸液的濁度約為90%），于Biolog GN微孔板中每孔加入150 μL菌懸液，使用微生物鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌的鑒定分析（謝關(guān)林，2000）。

1. 5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌基因組DNA的提取采用DNA提取試劑盒[DP302-02，天根生化科技（北京）有限公司]，其步驟按說明進(jìn)行操作。以原核生物保守基因16S rRNA引物27F/1492R（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'/1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行擴(kuò)增（楊霞等，2008）。將PCR產(chǎn)物送至昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果上傳至GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對分析，運用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹以明確病原菌的分類學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病原菌分離及其致病性測定結(jié)果

2. 1. 1 病害癥狀 三七根腐病常見于每年7—8月，恰逢云南省處于高溫高濕，為病害高發(fā)季節(jié)。病害發(fā)生時三七植株萎蔫，葉片發(fā)黃變軟，基部發(fā)黑;病害發(fā)生嚴(yán)重時葉片脫落，莖稈枯萎腐爛，植株輕輕拔起莖稈即斷，地下塊根仍腐爛埋在土里，蘆頭處顏色發(fā)黑腐爛直至整個根部腐爛（圖1-A）。

2. 1. 2 病原菌分離及篩選 從不同地區(qū)三七根腐病病組織上分離到500多株細(xì)菌，剔除重復(fù)后剩余200多株。經(jīng)室內(nèi)組培離體篩選，最后獲得10株細(xì)菌可在室內(nèi)引起三七離體組織塊根腐爛。篩選過程中發(fā)現(xiàn)健康三七接種其中1株細(xì)菌MA9后切傷組織的發(fā)病程度最嚴(yán)重，因此選取該株細(xì)菌進(jìn)行后續(xù)研究。

2. 1. 3 病原菌致病性測定 室內(nèi)離體接種MA9菌懸液測定結(jié)果顯示，健康塊根切傷接入MA9菌懸液9 d后出現(xiàn)菌膿，塊根開始腐爛變黑、變軟（圖1-C），并伴隨有惡臭味，而接種無菌水的三七塊根并無癥狀（圖1-B）;溫室灌菌驗證試驗結(jié)果顯示，三七接種MA9菌懸液50 d后，拔起塊根發(fā)現(xiàn)塊根與莖稈連接處顏色變?yōu)楹诤稚瑝K根變得皺縮稍軟，輕輕按壓有菌膿出現(xiàn)（圖1-D）。田間三七灌MA9菌懸液2個月后，發(fā)現(xiàn)有60%的三七塊根發(fā)生根腐，蘆頭與芽基結(jié)合處出現(xiàn)褐色水漬狀病變，隨著病變不斷擴(kuò)展最終導(dǎo)致三七地下塊根頂芽腐爛和地上部植株枯萎死亡（圖1-E）。連根拔起發(fā)現(xiàn)蘆頭處顏色變黑，出現(xiàn)斷芽和少芽現(xiàn)象，接入MA9菌株的塊根與健康塊根相比變得皺縮，少量伴隨創(chuàng)口（圖1-F和圖1-G）。對接種后的發(fā)病塊根蘆頭重新分離進(jìn)行柯赫氏法則驗證，再次獲得相同的病原細(xì)菌，證明MA9菌株即為三七根腐病病原細(xì)菌。

2. 2 病原細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征及培養(yǎng)性狀

MA9菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后形成黃橙色，略帶黏性，菌落呈半透明狀，圓形（直徑1～2 nm），邊緣整齊，中部稍有隆起，表面光滑有光澤的菌落（圖2-A），拉絲結(jié)果顯示為革蘭氏陰性菌。在NA培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的MA9菌落上滴加3% KOH溶液后1～2 s，菌落顏色由黃橙色變?yōu)榧t色（圖2-B）。

2. 3 病原菌生理生化鑒定結(jié)果

將MA9菌懸液接種到含有95種不同碳氮源的Biolog GN微孔板中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用Biolog微生物鑒定儀測定MA9菌株對碳氮源的利用情況，并與數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌菌株進(jìn)行比較。結(jié)果（圖3）表明，MA9菌株在Biolog GN微孔板上培養(yǎng)24 h后與數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chry-seobacterium indologenes）相似程度高，相似系數(shù)為0.570，與產(chǎn)吲哚金黃桿菌相似值為98%，對碳氮源的利用結(jié)果基本一致。

Biolog GN微生物鑒定儀讀板結(jié)果（表1）表明，MA9菌株能利用淀粉、吐溫80、D-果糖、α-D-葡萄糖、麥芽糖、松二糖、檸檬酸、丙酸、胸腺嘧啶核苷和D，L-α-磷酸甘油等40種碳氮源，而在N-乙酰基-D半乳糖胺、α-D-乳糖、D-葡萄糖酸、D，L-乳酸、羥基-L-脯氨酸和6-磷酸葡萄糖等16種碳氮源利用上可變。不能利用D-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-果糖、乳果糖、D-甘露醇、2-氨基乙醇和D-丙氨酸等39種碳氮源。

2. 4 16S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

以MA9菌株的總DNA作模板，使用16S rDNA通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序結(jié)果顯示MA9菌株（GenBank登錄號MK418541.1）與C. indologenes最相關(guān)，同源性為99%。將擴(kuò)增獲得的16S rDNA序列與GenBank中已公布的產(chǎn)吲哚金黃桿菌16S rDNA序列進(jìn)行比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖4可看出，MA9菌株與登錄號KT151112.1和KT151113.1的 C. indologenes菌株親緣關(guān)系最近，但與金黃桿菌屬其他種的菌株均存在較大遺傳差異。因此，確定引起云南三七根腐病的病原菌為產(chǎn)吲哚金黃桿菌。

3 討論

三七根腐病是危害嚴(yán)重的土傳病害，一旦發(fā)生對三七品質(zhì)及產(chǎn)量均有較大影響。三七根腐病病原菌較復(fù)雜，引起三七根腐病的病原真菌前人已有較多報道，如尖孢鐮刀菌、毀滅柱孢菌、莖點霉菌和鏈格孢菌等，但細(xì)菌引起的三七根腐病報道相對較少。鄭光植和楊崇仁（1994）認(rèn)為根腐病是一種細(xì)菌性病害;羅文富等（1999）首次提到細(xì)菌中的假單孢桿菌能與一些病原真菌復(fù)合侵染導(dǎo)致三七加快腐爛;官會林等（2005）認(rèn)為三七根腐病與細(xì)菌中的厭氧菌密切相關(guān)。細(xì)菌可能在三七根腐病中扮演重要角色，因此不能忽視對三七根腐病有害細(xì)菌的存在，這些細(xì)菌可能會加速三七根腐病的發(fā)生，應(yīng)明確對三七根腐病存在致病性的細(xì)菌種屬。

本研究分離獲得三七根腐病病原細(xì)菌產(chǎn)吲哚金黃桿菌MA9菌株。產(chǎn)吲哚金黃桿菌于1992年首次從豹蛙的組織和血液中分離獲得（Olson et al.，1992），國外學(xué)者在羊奶中亦分離到產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Callon et al.，2007），該菌作為條件致病細(xì)菌能引起水生動物如中華鱉、鯖魚和烏鱧發(fā)病（Boran et al.，2013;王鑫毅等，2016;楊移斌等，2018）。產(chǎn)吲哚金黃桿菌被人們認(rèn)知是作為罕見的人類機會性致病菌，被報道是引起腹膜炎和肺炎等的病原體（Aykac et al.，2016;Mukerji et al.，2016）。而MA9菌株是否也會作為一種機會性病原菌引起人或動物患病還有待進(jìn)一步驗證。產(chǎn)吲哚金黃桿菌作為植物病原細(xì)菌鮮有報道。劉纓等（2017）報道金黃桿菌屬PYR2可促進(jìn)棉花種子萌發(fā)及幼苗生長。說明產(chǎn)吲哚金黃桿菌的功能較復(fù)雜，可能與微生物所處的環(huán)境條件、地理位置、作物種類和致病型小種等有關(guān)。為進(jìn)一步探究產(chǎn)吲哚金黃桿菌在田間引起三七根腐病，本課題組對發(fā)生三七根腐病的根際土壤細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)從發(fā)生根腐病植株的根際土壤中也能分離到產(chǎn)吲哚金黃桿菌菌株，致病性測定結(jié)果表明該菌能引起健康三七發(fā)生根腐病。說明產(chǎn)吲哚金黃桿菌的確可作為病原菌引起三七根腐病，但產(chǎn)吲哚金黃桿菌侵染三七致病的具體原因仍需進(jìn)一步探究。

本研究在云南地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)產(chǎn)吲哚金黃桿菌能引起三七根腐病。因此，后續(xù)在云南三七根腐病發(fā)生區(qū)域應(yīng)實時監(jiān)測該病原菌在土壤中的豐度（如利用qRT-PCR或土壤微生物高通量測序技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測），密切關(guān)注該菌在三七根腐病地區(qū)的發(fā)展動態(tài)，進(jìn)行病害暴發(fā)的預(yù)警、預(yù)測，提前做好有針對性的防治措施，為不同地區(qū)引起三七根腐病病害的生物防治提供參考。目前，針對三七根腐病病原細(xì)菌產(chǎn)吲哚金黃桿菌的拮抗生防菌發(fā)掘及利用不同生防菌組合協(xié)同控制三七根腐病的研究工作已經(jīng)開展，期望能為三七根腐病的生物防治打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從三七根腐病病根組織上分離獲得產(chǎn)吲哚金黃桿菌MA9菌株，柯赫氏法則驗證MA9菌株對三七表現(xiàn)致病性，表明引起云南三七根腐病的病原細(xì)菌為產(chǎn)吲哚金黃桿菌。這是國內(nèi)首次報道產(chǎn)吲哚金黃桿菌能引起三七根腐病。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）