人發角蛋白生物材料的醫學應用

胡偉 唐紅楓

摘 要 近幾十年來，天然衍生生物材料以其良好的生物功能、結構支撐、良好的生物相容性和良好的生物降解性，在組織工程和再生醫學中得到了廣泛的應用。傳統上，角蛋白是從羊毛、羽毛、角和其他動物源中提取的用于工業用途的，它也被用作生物材料來開發用于生物醫學應用的支架、水凝膠和其他形式。近年來，從人發中提取的角蛋白作為一種來源于人體的蛋白質，具有良好的生物相容性、移植后無免疫反應、良好的細胞相互作用活性和生物降解性。近年來，人類毛發角蛋白提取技術的發展導致了各種類型的角蛋白生物材料的制備，這些材料已成功的用于組織再生醫用材料的制備。利用人發角蛋白為基礎的生物材料來進行轉化生物醫學應用，需要更好地了解角蛋白的分子特性和生物學功能。本文就人發角蛋白的分子特性、細胞間的相互作用、各種提取方法以及近年來在生物醫學上的應用進展作一綜述。

關鍵詞 人發角蛋白 生物材料 組織工程

1概述

近十年來，各種生物材料，包括合成聚合物、金屬、生物陶瓷和天然衍生生物材料，在組織工程和再生醫學領域得到了廣泛的應用。膠原等天然生物材料因其良好的生物相容性、生物功能性和生物降解性，在臨床應用中受到廣泛關注。例如，膠原蛋白在臨床上被廣泛用作真皮填充物、牙屏障膜、敷料膜、神經導管等，盡管它們與宿主細胞外基質相似，但在還存在很多問題值得研究，天然生物材料在臨床應用上的一個重要問題是體內植入后產生的免疫反應，包括由于其提取源而引起的過敏反應。因此，通過化學改性來改善生物相容性是當前的研究熱點。由于人發角蛋白是人源性的，具有優異的生物相容性，具有細胞相互作用的位點，并且表現出良好的生物相容性，被認為是一種有效的天然來源的降解性生物材料。此外，據報道，全球每年約有300000噸毛發被丟棄，從理發店、醫院等廢棄物中提供富含角蛋白的資源。傳統上從動物硬組織如羊毛、羽毛和角中提取的9種角蛋白已廣泛應用于化妝品行業。但從這些動物源中提取角蛋白的強酸強堿等劇烈條件會在一定程度上破壞角蛋白的三維結構，而在相對溫和的條件下從人發中提取角蛋白的最新進展，已導致大量角蛋白生物材料的成功應用。本報告綜述了人發角蛋白的分子特性、各種提取方法以及近年來在生物醫學領域的應用。

2角蛋白的分子特性

角蛋白是一種天然蛋白質，屬于中空纖維，是橋粒細胞連接的細胞骨架成分。角蛋白分為兩類，即Ⅰ型（酸性）角蛋白和Ⅱ型（堿性）角蛋白。在頭發、角、羽毛和指甲中發現的硬角蛋白（5%硫）被分為Ia型（酸性硬蛋白）和IIa型（堿性硬蛋白），而表皮角蛋白如皮膚角質層（1%硫）被分為Ib型（酸性軟蛋白）和IIb型（堿性軟蛋白）;分類取決于氨基酸的組成、分布和功能。硬角蛋白和軟角蛋白在螺旋構象中具有相似的肽結構，但它們的氨基酸組成不同，一般來說，硬角蛋白以其高半胱氨酸含量、低甘氨酸含量和具有結構耐久性和強度而區別，而軟角蛋白則相反。關于二級結構，角蛋白可進一步分為兩類：具有 螺旋結構的 角蛋白和具有 折疊片層結構的 角蛋白。人發角蛋白分為硬角蛋白，由65-96%的蛋白質、1-9%的脂質、3%的黑色素和少量化合物組成，主要取決于水分含量。人的頭發纖維包含三個不同的部分：角質層、皮層和髓質。角質層是頭發纖維的外層，主要由5-12層 角蛋白組成，起保護內層和保持水分的作用;皮層是一束蛋白質鏈，主要由 角蛋白（50-60%）、 角蛋白（20-30%）和黑色素顆粒組成，人發角蛋白存在于皮質內，占整個頭發總質量的70-95%;髓質是位于毛發纖維中心的柔軟疏松的軸向細胞。存在于皮質層的 角蛋白，由于其獨特的結構和生物學功能，在生物醫學工程中得到了廣泛的應用。在人發中， 角蛋白的兩個亞型，Ⅰ型（酸性）角蛋白和Ⅱ型（堿性）角蛋白相互作用，形成左手異二聚體螺旋。然后兩個二聚體反平行結合形成右手四聚體，這個過程持續進行，直到隨后聚合成10納米長的螺旋狀中間絲。在卷繞線圈中間長絲形成過程中，在形成二聚體、四聚體、八聚體等的各個階段都會改變螺旋方向。最后， 角蛋白的超薄結構纖維的形成由數千束微纖維完成（圖1）。 角蛋白單體的分子量為40-50 kDa（I型）和50-60 kDa（II型）。在頭發中發現的 角蛋白，也稱為基質蛋白或角蛋白相關蛋白（KAPs），是一種分子量為10-25kda的高硫 角蛋白，作為粘合材料將細絲結合在一起并維持頭發纖維的結構。

3角蛋白的生物學特性

毛發角蛋白是在毛發發育周期中形成于上皮卵泡細胞的細胞內細胞骨架蛋白，包括生長期（生長期）、增殖期（生長期）和休止期（休止期）。表皮生長因子、細胞因子和其他信號分子等化學信號參與了各個階段的調節。生長是毛囊周期的第一階段，BMP信號已經被證明是在此階段參與毛囊分化。毛囊細胞在生長期角質化，角質單體聚合成中間絲，完全角化的細胞最終通過凋亡而死亡，包括中間絲在內的內部細胞器被排出體外。由內根鞘（IRS）和外根鞘（ORS）覆蓋的發干（HS）變得密集地充滿角蛋白絲。發干中的角蛋白從頭皮中出來并暴露于空氣中，導致角蛋白的氧化，最終形成細長的纖維結構。生長期過后，來到了動態過渡期，在此期間，頭發生長結束，毛囊進入休息期，導致脫發，然后開始一個新的周期。角蛋白的主要功能之一是保護上皮細胞免受物理損傷和非物理應激，但最近有報道稱，角蛋白也具有其他細胞蛋白功能的調節，包括參與細胞信號傳導，以及應激相關機制。頭發中的角蛋白形成了細胞內的細胞骨架中間絲，對于細胞起到支撐作用，然而人發中角蛋白的除結構支撐以外其他的生物學功能尚未得到很好的闡明。最近報道，角蛋白分子由約400～600個氨基酸組成，含有多種細胞結合位點，如LDV（LU-ASP-VALL）和RGD（ARG-GLY ASP）。例如，毛發角蛋白被用作細胞培養的涂層材料時，支持細胞粘附和提高細胞增殖。據報道， 4 1整合素家族在細胞中識別出含有類似細胞粘附基序的角蛋白基質，在人發角蛋白膜上培養的細胞中觀察到發育良好的 1整合素表達（圖2）。角蛋白作為一種細胞外基質，具有支持細胞間相互作用和細胞間基質相互作用的生物學功能，已成為許多生物醫學應用的潛在生物材料。然而，細胞與角蛋白基生物材料相互作用的機理仍需進一步研究。

4人發角蛋白提取方法

傳統方法是從動物源（如羊毛、角和頭發）中提取角蛋白，對傳統方法進行稍加改進的方法可以用來從人類頭發中提取角蛋白。頭發中的硬角蛋白由于其角蛋白分子和疏水氨基酸中胱氨酸殘基中的二硫鍵含量高而高度不溶，因此頭發中硬角蛋白的提取需要苛刻的條件和進一步的修飾以穩定角蛋白分子，其中首要問題就是能夠在不破壞肽鍵的情況下使二硫鍵斷裂，從而從頭發中提取角蛋白。如圖3所示，頭發角蛋白的提取過程包括四個步驟，包括去甲酰化、增溶、透析和冷凍干燥。在提取過程中， 角蛋白主要從皮質層中提取，并通過離心去除嵌入表皮層中的不溶性 角蛋白。為了有效地從人發中提取角蛋白，許多研究人員開發了多種技術，使用各種試劑的混合物以及熱、機械力和水解緩沖液的組合。這些過程是基于氧化還原化學反應來打破硬角蛋白中的二硫鍵和增加角蛋白溶解度的試劑。對于這些提取條件的總結（見表1）。在基于還原法的角蛋白提取中，角蛋白分子中的二硫橋很容易被打破，并通過堿性水解還原為巰基，生成角蛋白的還原形式角朊酸。角質層是保護頭發內蛋白質的多層膜，在堿性狀態下容易抬升，在pH值為10到13的高堿性條件下，NH3+和COO-基團之間的離子相互作用首先減弱，導致二硫鍵斷裂，角蛋白結構部分展開，還原劑更容易接觸到角蛋白。 近年來最廣泛使用的試劑之一是由Nakamura等人建立的Shindai溶液，它由25 M M Tris HCl、2.6 M硫脲、5 M尿素和5%（v/v）2-巰基乙醇組成。尿素和硫脲主要作用是使頭發纖維中氫鍵斷裂，并最終促進還原劑容易地與角蛋白分子的二硫鍵結合。加入2-巰基乙醇，通過其硫代陰離子的反應來破壞二硫鍵，加入三鹽酸，以調節到最佳的pH環境。一般來說，在氫氧根離子存在下，二硫鍵很容易在高pH下水解，但在pH 10以上的堿性條件會引起肽鏈的破壞。

5人發角蛋白生物材料的生物醫學應用

利用天然衍生的生物材料，如膠原蛋白、透明質酸、明膠、海藻酸鈉和殼聚糖，已經在生物醫學材料的開發中進行廣泛的研究。近年來，人發角蛋白因其良好的生物相容性、生物降解性以及細胞整合素與角蛋白分子內特定氨基酸序列之間良好的細胞相互作用而受到生物醫學工程領域的廣泛關注。角蛋白在生物醫學應用中最顯著的優點之一是它可以從人的頭發等來源中提取，植入后可能引起非常低的免疫反應。角蛋白已經被制備成各種生物材料支架，如薄膜和水凝膠;其他支架可以通過角蛋白和聚合物的混合來制備。基于角蛋白的生物材料已被用于多種生物醫學應用，包括用于周圍神經再生的神經導管填料、用于傷口愈合的水凝膠或薄膜、止血劑和用于組織再生的其他形式。人發角蛋白由于其高半胱氨酸殘基含量，具有自發的自組裝和聚合特性，可以制備各種生物材料，如薄膜、水凝膠和大孔支架，其良好的細胞相互作用和生物相容性，特別是人發角蛋白由于基于人源蛋白質，所以具有低免疫原性，使其在再生醫學上將會有更廣泛的應用。人發角蛋白的生物醫學應用的深度和廣度，一方面是要設計促進組織再生的功能性生物材料，需要進一步研究其與細胞間的相互作用;另一方面是要研究控制和增強人發角蛋白為基礎的生物材料的機械強度，使其能在硬組織再生中得到應用。隨著有效提取角蛋白方法效率的進一步提高，能夠開發出適合于更多特定生物醫學應用場景，具有適當生物相容性和機械特性的角蛋白基生物材料，使角蛋白生物材料的醫學應用前景更加廣闊。

參考文獻

[1] DeFrates，K.G，etal.Protein-Based Fiber Materials in Medicine： A Review[J].Nanomaterials，2018，8（07）.

[2] Wessing，B.&S.Lettner&W.Zechner.Guided Bone Regeneration with Collagen Membranes and Particulate Graft Materials： A Systematic Review and Meta-Analysis[J].Int J Oral Maxillofac Implants，2018，33（01）：87-100.

[3] 黃艷萍，但年華，但衛華.靜電紡絲制備膠原基復合納米醫用纖維的研究進展[J].材料導報，2019，33（19）：3322-3327.

[4] Bunyaratavej，P.&H.L.Wang.Collagen membranes： a review[J].J Periodontol，2001，72（02）：29-215.

[5] Schwartzmann，M.Use of collagen membranes for guided bone regeneration： a review[J].Implant Dent， 2000，9（01）：6-63.

[6] Stoecklin-Wasmer，C.，etal.Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration： a systematic review[J].J Dent Res， 2013，92（09）：81-773.

[7] 鄒鵬.PHBV纖維支架的表面功能化及其生物相容性的研究[D].長沙：湖南大學，2016.

[8] 李鵬飛.人發角蛋白的提取及其生物醫學應用研究[D].南京：南京師范大學，2015.

[9] Fraser，R.D.，etal.Intermediate filaments in alpha-keratins[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1986，83（05）：1179-1183.

[10]? ?Shimomura，Y.&M.Ito， Human Hair Keratin-Associated Proteins[J].Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings.

[11]? ?Geisler，N.&E.Kaufmann&K.Weber.Antiparallel orientation of the two double-stranded coiled-coils in the tetrameric protofilament unit of intermediate filaments[J].Journal of Molecular Biology， 1985，182（01）：173-177.

[12]? ?Laura，A.The hair cycle[J].Journal of cell science，2006，3（119）.

[13]? Toivola，D.M.etal.Effects of Keratin Filament Disruption on Exocrine Pancreas-Stimulated Secretion and Susceptibility to Injury.

[14]? ?Makarem，R.&M.J. Humphries.LDV： a novel cell adhesion motif recognized by the integrin alpha 4 beta 1，1991，19（04）： 380S.

[15]? ?孫占美，et al.回收羊毛角蛋白的再溶解性能研究[J].毛紡科技，2019，47（06）：54-59.

[16]? ?王倩倩，etal.硫化鈉提取人發角蛋白研究[J].紡織高校基礎科學學報，2019，32（02）：190-195.

[17]? ?Shuai，W.，et al.Human keratin hydrogels support fibroblast attachment and proliferation in vitro.

[18]? ?Nakamura，A，etal.A Rapid Extraction Procedure of Human Hair Proteins and Identification of Phosphorylated Species[J].Biological & Pharmaceutical Bulletin.