稻米直鏈淀粉含量的96微孔高通量快速測定方法

陳瑩 楊瑰麗 郭濤 吳銳 李日文 黃翠紅 周丹華 王慧

摘要： 直鏈淀粉含量的快速高通量測定方法對國際標準法（簡稱“國際法”，BS EN ISO6647-2：2015《稻米 直鏈淀粉含量的測定 第2部分 常規方法》）進行了改良，可以極大地提高水稻育種材料的篩選效率、適應當前水稻稻米品質育種的新需求。結果表明，高通量法測得的吸光度與直鏈淀粉含量有良好的相關性，相關系數達0.991 1，該方法直鏈淀粉含量的測定值與國際法的測定值無顯著差異;同時，高通量法還具有簡單、易操作、樣品量少、批量（96個樣本）測定等優點，能用于水稻誘變群體后代或品種選育過程中的海量株系大規模初篩，可極大地提高稻米品質研究的效率。

關鍵詞： 大米;直鏈淀粉含量;96微孔高通量快速測定方法;吸光度;相關性

中圖分類號： TS210.4? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0185-04

大米是世界上最重要的糧食作物之一，我國作為大米最重要的生產國和消費國，對大米的品質也提出了越來越高的要求[1]。直鏈淀粉作為大米的重要組成，一直被認為是影響大米蒸煮食味品質的關鍵因素[2-4]。直鏈淀粉是D-葡萄糖基通過 α-（1，4） 糖苷鍵連接而成，空間構想卷曲成螺旋形，是帶有少量α-（1，6）分支（小于0.1%）的線性小分子[5-6]。一般來說，大米中直鏈淀粉含量高，米飯偏硬，飯粒干燥而蓬松，色澤較暗;相反，米飯較柔軟而有彈性，飯粒光澤度好[7]。

目前，國內外測定直鏈淀粉含量的標準方法主要有以下3種：國際標準BS EN ISO6647-2：2015《稻米 直鏈淀粉含量測定 第2部分 常規方法》（簡稱“國際法”）、國家標準GB/T 15683—2008《大米直鏈淀粉含量的測定》、原農業部標準NYT 2639—2014《稻米直鏈淀粉的測定 分光光度法》。這3種標準方法的原理都是利用碘比色法，主要區別在于脫脂及顯色步驟等方面。國家標準規定須要對材料進行甲醇溶液回流抽提脫脂，此步驟操作復雜、耗費時間、技術性強，且上述3種方法均需要較多的樣品以及試劑，這都不利于對大批量樣品實施高效、準確的檢測。

基于直鏈淀粉廣泛的應用前景，以及其含量在評價糧食品質和農業選種、育種時的實際意義，本研究報道一種結合微孔板分光光度計高通量、快速測定稻米直鏈淀粉含量的方法。與以上3種方法相比，樣品前期處理不須脫脂，簡單易行;所需樣品量少，最少僅需10 mg;樣品的糊化和顯色步驟均在 2 mL 離心管中進行，易于操作，測定周期大大縮短;可以一次完成96個樣品的測量，單位時間內（1 d）可測定多個批次樣品，尤其適用于大規模的突變體及育種材料的直鏈淀粉含量的初篩。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

蒸餾水;95%乙醇溶液;氫氧化鈉溶液：1.0 mol/L 氫氧化鈉溶液、0.09 mol/L氫氧化鈉溶液;1 mol/L乙酸溶液;碘試劑：稱取（2.000±0.005） g碘化鉀，加適量的水以形成飽和溶液，加入（0.200±0.001） g碘，碘全部溶解后溶液定量移至100 mL容量瓶中，搖勻;已知直鏈淀粉含量的大米粉標準品：中國水稻研究所;試驗用的12個品種分別為華航絲苗、勝巴絲苗、華航33號、象牙香占、興寧黑糯、華航31號、黃廣華占1號、合莉油占、金農絲苗、桂育9號、桂禾豐、美香占2號，分別對應樣1 至樣12。

1.2 試驗原理

將大米粉碎至細粉以破壞淀粉的胚乳結構，使其易于分散及糊化，將試樣分散在氫氧化鈉溶液中，向一定量的試樣分散液中加入碘試劑，大米淀粉與碘形成顯色復合物，在波長620 nm處測定顯色復合物的吸光度，其吸光度與直鏈淀粉含量成正比。

1.3 試樣的制備

原始稻谷樣品收獲后在實驗室常溫放置3個月。經礱谷、碾米過程制成精米，取至少10 g精米，用高速粉碎機粉碎成粉末，過100目篩，置于密封袋中室溫保存備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 按國際法處理樣品

稱取（100±0.5） mg試樣于100 mL錐形瓶中，小心加入1.0 mL乙醇溶液到試樣中，將粘在瓶壁上的試樣沖下。移取 9.0 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液到錐形瓶中，并輕輕搖勻，隨后將混合物在沸水浴中加熱10 min或在封口瓶中靜置過夜以分散淀粉，取出冷卻至室溫（如果是采取加熱方式分散淀粉）。轉移到100 mL容量瓶中。加蒸餾水定容后，劇烈振蕩混勻。

準確移取0.5 mL樣品溶液到預先加入5 mL水的20 mL帶蓋的比色管中，加0.1 mL乙酸溶液，搖勻，再加入0.2 mL碘試劑，最后加入4.2 mL水至比色管中，使液體容積達到10 mL，搖勻，用空白溶液調零，利用7239G型可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）在620 nm處測定其吸光度（表1）。

1.4.2 按高通量法處理樣品

稱取（10±0.2） mg試樣于2 mL離心管中，小心加入0.1 mL乙醇溶液到試樣中，再移取0.9 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液到離心管中，渦旋，混勻，隨后順時針離心約5 s，并置于其林貝爾儀器制造有限公司生產的GL-1800型干式恒溫器中85 ℃加熱20 min以分散淀粉，取出冷卻至室溫。

準確移取0.01 mL樣品溶液到預先加入約 2 mL 水的2 mL離心管中，加0.02 mL乙酸溶液，搖勻，再加入0.04 mL碘試劑，搖勻，靜置 10 min，用空白溶液調零，使用移液槍準確移取4個標準樣以及91個待測的樣品各300 μL至96孔塑料微孔板中，借助微孔板分光光度計（美國伯騰儀器有限公司）在620 nm處測定吸光度（表1）。

2 結果與分析

2.1 2種方法操作過程的差異分析

國際法和高通量法測定大米直鏈淀粉含量的差異主要表現在使用的材料與試劑用量、測定時間等方面。前者對試劑以及去離子水消耗大，測量耗時長;而后者測量耗時短，涉及的試劑用量少且更易操作。

2.2 標準曲線的建立

選取直鏈淀粉含量分別為0.4%、10.6%、16.2%、26.5%的4個標準品，同時利用本試驗的高通量法與國際法測定其吸光度，國際法參照國際標準BS EN ISO6647—2：2015《稻米 直鏈淀粉含量測定 第2部分 常規方法》，所測結果繪成標準曲線（圖1）。國際法的線性相關系數r2為0.999 7，高通量法標準曲線的線性相關系數r2為0.991 1，說明2種方法測得的吸光度均與直鏈淀粉含量有良好的線性關系。

2.3 2種方法的顯著性分析

分別按國際法和高通量法測定12份大米樣品的直鏈淀粉含量，每份材料設置6個平行樣，取6次測定值的平均數為最終結果（表2）。用SAS統計軟件對數據t檢驗分析結果，得到P值=0.445 9>0.05，說明直鏈淀粉含量測定的國際法與高通量法之間并無顯著性差異。

2.4 2種方法測定結果的描述性分析

分別按國際法和高通量法對12份大米樣品進行6次重復測定，并對測定結果進行分析。由表3可知，高通量法的變異系數范圍為3.77%～10.15%，國際法測定結果的變異系數范圍為 1.48%～12.91%，高通量法中的變異系數普遍高于國際法，但其直鏈淀粉含量的測定結果所呈現的趨勢基本相同。F檢驗結果表明，這2種方法所得的各個樣品間差異均不顯著，證明高通量法測定結果可靠，完全可以滿足對大批量樣品的初步測定和篩選。

3 討論與結論

稻米的淀粉包括直鏈淀粉和支鏈淀粉2個部分，兩者之和約占稻米成分的90%，其中直鏈淀粉含量變化為0～40%，是決定稻米食味品質的重要性狀之一[8]。自首次提出通過碘比色法測量稻米直鏈淀粉含量以來，稻米直鏈淀粉含量的測定技術一直在不斷發展變化。從單波長比色法，經過改進提出了雙波長比色法和多波長比色法，進一步發展出基于碘比色法的一系列新測定技術，如碘親和力測定法、伴刀豆球蛋白法、自動分析檢測儀。甚至利用稻米理化特性，引進新的檢測儀器，開發出近紅外光譜分析法、高光譜法、RVA快速黏度分析法等檢測手段;以及基于分子基團特性開發出色譜分析法、差示掃描量熱法、非對稱流場流分離技術等[8-15]。

基于碘比色法的大米直鏈淀粉含量測定方法因成本較低且結果可靠，成為目前各實驗室最常使用的方法。本研究摒棄了標準法中使用100 mL容量瓶定容的操作，采用2 mL離心管，不僅大大節省了試劑和水資源，而且便于通過干式恒溫器進行加熱，能在保證充分糊化的同時也利于操作，并開創性地使用了微孔板分光光度計，配套器材是96孔塑料微孔板，利用96孔微孔板分光光度計，對稻米直鏈淀粉含量進行快速高通量的測定。試驗結果表明，大米直鏈淀粉含量高通量測定法與國際法無顯著性差異，標準曲線相關系數r2=0.991 1，呈現良好的線性關系，操作簡單，是一種快速高效的測定直鏈淀粉含量的方法，可用于水稻誘變群體后代或品種選育過程中的海量株系大規模初篩，極大地提高了稻米品質研究的效率。

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收 稿日期：2019-02-22

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2017YFD0100104）。

作者簡介：陳 瑩（1994—），女，安徽淮南人，碩士，主要從事水稻食味品質改良研究。E-mail：qazwsxedc1577@163.com。

通信作者：王 慧，博士，教授，主要從事高產優質常規稻育種、雜交稻恢復系選育和分子改良以及空間誘變機理研究。E-mail：wanghui@scau.edu.cn。