人工栽培蛹蟲草液體菌種發酵工藝優化

馬麥艷 陳方圓 張相鋒 焦子偉

摘要： 近年，隨著人工栽培蛹蟲草面積逐年擴大，迫切需求大規模培育蛹蟲草菌種，尤其是液體菌種來滿足日益擴大的再生產的需要。采用正交試驗設計，選取pH值、溫度、通氣量3個因素，每個因素設置3個水平，進行液體菌種發酵工藝試驗，分析蛹蟲草子實體生長影響及生物轉化率變化情況。通過試驗得到人工栽培蛹蟲草液體菌種發酵的最佳組合條件。不同處理對蛹蟲草子實體生長有明顯變化，3種因素對蛹蟲草的生物轉化率影響為：溫度>通氣量>pH值，其最優組合為溫度20 ℃、pH值5.5、通氣量2 L/min。

關鍵詞： 蛹蟲草;子實體;液體發酵;工藝優化

中圖分類號： S567.3+50.4? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0143-05

近年來，由于野生蟲草（Cordyceps militaris）過度開采造成產量急劇下降且使其生長環境遭到破壞，人工栽培蛹蟲草面積逐年擴大，這就迫切需求大規模培育蛹蟲草菌種，尤其是液體菌種來滿足日益擴大的再生產的需要。國外已進行了蛹蟲草人工栽培相關技術的研究，采用仿生栽培、固體培養基栽培、液體培養基培養等多種方式進行了人工培養并得到了蛹蟲草的子實體[1-2]。深層發酵技術目前已運用到食品、藥劑等產品生產方面，Kitakaze等和Vinadé等在蛹蟲草液體培養方面做了大量的工作[3-4]。國內學者對蛹蟲草液體發酵技術進行了相關研究，任昕雯等以大米、啤酒糟共培養的蛹蟲草固態發酵產物為原料，利用響應面法優化提取條件研究了液體發酵條件對蛹蟲草產蟲草素的影響[5]。張楠等對蛹蟲草深層發酵產蟲草素培養基進行了優化[6]。秦鵬等研究了不同添加物對蛹蟲草液體發酵蟲草素的影響，確定了3種生長素使用的最佳質量濃度，并對各質量濃度下蛹蟲草生長情況進行了分析與討論[7]。蛹蟲草液體發酵相關研究大多是針對其某一影響因素進行了探討，但針對蛹蟲草菌種資源用于液體發酵的研究仍較少。結合新疆伊犁當地實際，本研究利用新疆蛹蟲草菌種，采用正交試驗設計，選取pH值、溫度、通氣量3個因素，每個因素設置3個水平，研究液體菌種發酵對蛹蟲草產子實體生長的影響，分析蛹蟲草生長情況及生物轉化率。進一步掌握蛹蟲草液體菌種擴大發酵的最佳工藝條件，提供優質蛹蟲草液體發酵菌種，滿足伊犁乃至新疆地區大面積規?；斯ぴ耘嘤枷x草的需要。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株均來源于筆者實驗室，人工篩選獲得的MAT1-1和MAT1-2不同交配型代表菌株[8]。

1.1.2 供試培養基

改良PDA固體培養基：參照努爾買買提[9]等所述方法。

改良PD液體培養基（g/L）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨3 g、磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2 g、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 1 g和復合維生素B 25 mg，pH值6.5～7.0。

種子發酵培養基采用改良PD液體培養基。

1.1.3 供試培養設備與介質

Liflus GX多功能生物發酵系統、組培玻璃瓶（規格：350 mL，高108 mm，直徑75 mm，口徑69 mm）、人工栽培基質大米等。

1.2 液體菌種發酵

1.2.1 種子液制備

將不同遺傳交配型代表菌株無菌接種至改良PDA培養基，于21 ℃下恒溫光照培養15 d后，用滅菌牙簽挑取分生孢子，接種至含有50 mL改良PD液體培養基的錐形瓶中，170 r/min，21 ℃恒溫下搖培3～4 d后備用。

1.2.2 發酵罐調試與滅菌

進行溶氧電極（INPRO6800）準備;按照要求配制不同pH值校準液對pH值電極405-BPASPH值進行校準;將每個相關部件都安裝到發酵罐對應位置上，121 ℃下滅菌20～30 min，再快速移至無菌操作臺下備用。

1.2.3 發酵培養

在無菌條件下先倒入滅菌的PD培養基于發酵罐中，將不同遺傳交配型的種子液等體積混合，再按發酵液體培養基 ∶種子液=（10～15） ∶1（體積比）的比例，加入適量的混合種子液于發酵罐中;開通各個電源，通過蠕動泵調節對應條件的酸、堿量;按不同處理的發酵條件分別進行發酵培養，每個處理培養3～4 d，當發酵罐中菌絲球布滿培養液時發酵完成。

1.2.4 發酵液保存

將不同處理的發酵液體菌種無菌條件下倒入已滅菌的玻璃容器內現用，或放入4 ℃冰箱暫時保存備用。

1.3 人工栽培

1.3.1 栽培培養基滅菌

參照努爾買買提等的方法[9]，每個組織培養瓶裝入20 g大米，加入15 mL改良PD培養基，搖均加蓋后放入大滅菌鍋內，115 ℃ 下滅菌3 h后備用。

1.3.2 人工培養

無菌條件下分別吸取7.5 mL不同處理的發酵液體菌種接種于每瓶栽培培養基中，并將接種好的不同處理的組織培養瓶放置于（21±1） ℃的人工栽培室培養架上培養55～60 d，直至蛹蟲草子實體成熟。每個處理設置3個重復，每個重復接種100瓶。

1.3.3 觀測與分析

定期對不同處理的蛹蟲草菌絲體、子實體生長情況進行觀測，并對不同處理所收獲的蛹蟲草子實體長度、鮮質量、干質量、生物轉化率以及產量等指標進行分析與評價。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗設計

根據預試驗結果，本試驗采用正交試驗設計，選取pH值（A）、溫度（B）、通氣量（C）3個因素，每個因素3個水平，即3因素3水平進行優化，計9個處理（表1）。

1.4.2 數據處理

本試驗數據以平均值為依據，采用Excel軟件、SPSS軟件（Version 11.5，USA）進行數據處理和正交分析。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草菌絲生長分析

通過對不同發酵條件處理的蛹蟲草菌絲生長情況進行觀察與記錄，獲得相關數據。不同處理經接菌、人工栽培后，剛開始各處理的蛹蟲草菌絲生長情況均表現較好態勢，接種后3～5 d蛹蟲草菌絲體布滿整個培養基質，呈白色。但隨時間推移，不同處理的蛹蟲草菌絲在菌絲密度、菌絲轉色及菌餅變黃時間情況開始出現明顯差異。其中，處理1、處理4組蛹蟲草菌絲密度最好，菌絲轉成橘黃色速度最快，菌餅變黃時間最短，為9 d;處理2、3、5、8、9組蛹蟲草菌絲密度較好，變黃時間短及菌絲轉成橘黃色速度較快;處理6、7組蛹蟲草菌絲密度最差，菌絲轉成橘黃色速度慢且菌餅變黃時間最長，為12 d（表2）。

2.2 蛹蟲草子實體生長分析

對不同處理的蛹蟲草子實體生長情況進行觀察與記錄，獲得相關結果。不同處理的蛹蟲草子實體生長及生物學指標各不相同。除處理6和處理7外，其他各處理的蛹蟲草子實體均生長良好。其中，處理1及處理4組表現最好，子實體形成時間最早、子座粗長、均勻、子實體正常，橘紅色、有子囊殼、出草質量好;處理2、3、5、8、9組均表現較好，出草時間較早、子座較粗長、均勻、子實體較正常，橘紅色、有子囊殼、出草質量較好;處理6和處理7出草較晚、子座粗而短、僅部分出草，橘紅色、出草質量一般（表3、圖1）。

2.3 蛹蟲草出草比較

待子實體成熟后，對不同處理蛹蟲草子實體的相關生物學指標進行記錄分析，可以看出不同處理蛹蟲草在子實體長度、鮮質量、干質量、鮮干比和生物轉化率方面均呈顯著性差異（P<0.05）。

其中，處理4蛹蟲草的各項指標最好，子實體平均長度為6.01 cm、鮮質量為10.19 g、干質量為1.48 g、鮮干比為7.02、生物轉化率為50.93%;處理1蛹蟲草的各項指標表現略次于處理4，除鮮質量、鮮干比及生物轉化率指標外，子實體長度和干質量指標均低于處理4，且呈顯著性差異;處理6和處理7蛹蟲草的各項指標均表現較差，這2個處理之間除子實體長度呈顯著性差異外，其他指標如鮮干質量、鮮干比、生物轉化率方面未呈現顯著性差異（表4）。

由表4可知，不同處理在子實體長度、鮮質量、干質量、鮮干比和生物轉化率方面均有差異。圖2以生物轉化率為例，發現不同處理的蛹蟲草生物轉化率均有差異。其中，處理4組表現最好，生物轉化率最高，為50.93%;處理1、2、3、5、8、9組生物轉化率較高;處理6和處理7生物轉化率較低，分別為11.23%和16.4%。

以生物轉化率為例對不同處理的蛹蟲草子實體數據進行正交分析，發現不同發酵條件對蛹草菌生物轉化率影響為：溫度（B）>通氣量（C）>pH值（A），3個因素均不顯著（P<0.05）。最優組合為A1B1C2，即溫度20 ℃，pH值5.5，通氣量2 L/min（表5、表6）。

3 討論

目前，國外在蛹蟲草液體深層發酵方面也進行了摸索[10-12]，并取得了一定的成果。國內大都對其液體發酵某一影響因素進行相關研究，如楊杰等研究以蛹蟲草菌絲生物量為指標，通過單因素試驗從裝液量、通氣量、發酵起始pH值和接種量4個方面進行優化，結果表明裝液量為35 L/罐，通氣量為0.9 m3/h，起始pH值6.45，接種量20瓶（每瓶 500 mL）/罐（60 L）為最佳[13]。周廣麒等研究發現使用30 L大型生物反應器中進行發酵菌絲體，通氣量為1.21 m3/h較好[14]，與楊杰等研究的結果[13]相似。本研究采用3因素3水平正交試驗，結果表明，不同處理對蛹蟲草生長有一定的影響，不同溫度、不同pH值和不同通氣量對蛹蟲草子實體生長有明顯影響，3種因素對蛹蟲草子實體的生物轉化率影響為：溫度（B）>通氣量（C）>pH值（A），其最優組合為溫度20 ℃、pH值5.5、通氣量2 L/min。進一步明確了蛹蟲草液體菌種發酵的不同影響因素和最佳工藝條件，這為蛹蟲草液體發酵技術提供了技術依據和支撐。當然不同體積的發酵罐，以及在不同小試、中試生產階段對蛹蟲草液體發酵工藝條件均有影響，還需要以此為基礎做進一步分析與研究。此外，還需要對發酵罐進行優化，實現液體發酵與接種有機統一，節本增效，用于規模化生產。

4 結論

采用正交試驗法進行了蛹蟲草液體菌種發酵工藝優化，3個因素影響其生物轉化率順序為溫 度> 通氣量>pH值，得到了最優發酵組合條件，即最優組合為A1B1C2，即溫度20 ℃，pH值5.5，通氣量2 L/min。

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收 稿日期：2019-01-17

基金項目：新疆維吾爾自治區科技支疆項目（編號：2017E0239）。

作者簡介：馬麥艷（1994—），女，新疆霍城人，碩士研究生，研究方向為人工蛹蟲草栽培與示范。E-mail：1034277602@qq.com。

通信作者：張相鋒，碩士，講師，研究方向為微生物生態，E-mail：759737497@qq.com;焦子偉，博士，教授，研究方向微生物生態及綠色有機農業有害生物防控，E-mail：741285332@qq.com。