拮抗凡隆氣單胞菌的海洋放線菌AC08F5的鑒定及活性物質初步研究

陳靜 夏艷秋 朱強

摘要： 從21株分離自海洋環境的放線菌中篩選出1株放線菌菌株AC08F5，該菌株對凡隆氣單胞菌溫和生物型（Aeromonas veronii biovar sobria）NQ菌株有明顯抑制作用;通過顯微形態和培養特征觀察、生理生化反應和16S rDNA分子鑒定，將其鑒定為鏈霉菌屬。試驗對該菌株的活性物質對熱、pH和紫外照射的穩定性進行了初步研究，結果顯示，在70 ℃以下、pH值4～10條件下抑菌活性相對穩定，并具有很強的抗紫外線照射能力。

關鍵詞： 海洋放線菌;鑒定;凡隆氣單胞菌;穩定性

中圖分類號： S182? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0175-06

水產病原微生物中出現大量抗生素耐藥類型主要是由于在水產養殖中大量使用合成抗生素和藥物導致的[1]。利用微生物代謝產物來有效防治水產動物疾病，已經成為當前水產養殖工作的重要方向。在水產養殖領域，隨著研究的深入發展，人們越來越重視來源于海洋的有益微生物資源及其代謝產物的開發和應用。目前，海洋細菌及其代謝產物用于水產抗病和水環境保護等方面的研究比較多。

海洋放線菌是新化學結構物質豐富的來源，在海洋放線菌研究方面，一是以篩選抗病毒、抗腫瘤活性產物為主要研究目標，二是以篩選抗菌、抑菌菌株應用于農作物病害的研究較多[2-6]。而海洋放線菌應用于防治水產病原菌病害研究相對較少，但已有諸多研究者將海洋放線菌應用于水產養殖致病菌引起病害的預防。中山大學游建嵐等報道了利用海洋放線菌治療和預防由致病性弧菌引起的蝦病害，具有抑制弧菌菌膜的形成，在養殖水體可以降解淀粉、蛋白等大分子，產抗菌類物質以及形成耐熱耐干燥的孢子的優點，海洋放線菌具有成為益生菌的潛力[7-8]。Das等將海洋鏈霉菌作為益生菌應用于斑節對蝦（Penaeus monodon）養殖，發現具有促進蝦生長的作用[9]。Kumar等研究人員則將從海洋放線菌中提取的抗菌物質與食物一同喂養凡納濱對蝦，對蝦產生具白斑綜合征病毒的抗病毒效應[10]。隨著研究深入，人們發現海洋放線菌及其次級代謝產物已成為尋找新抗生素的重要來源[11]，而直接使用放線菌作為益生菌，相對來說其出現抗性基因橫向轉移機會低，值得在水產養殖中推廣應用[12]，且具有重要的應用價值。

凡隆氣單胞菌是近些年確定的氣單胞菌科的新種，在水產養殖上逐漸成為危害性較大的病原菌。由于該菌的感染，曾引發孟加拉國魚類的流行性潰瘍綜合癥，國內丁[XCZ26.tif;%118%118]、羅非魚、中華絨螯蟹及泥鰍、甌江彩鯉等水產動物也因此患病，給養殖業帶來較大的經濟損失[13]。本研究對凡隆氣單胞菌有較好抑制作用的海洋放線菌菌株AC08F5進行了鑒定并對其抑菌活性物質的穩定性進行了初步研究，以期為開發水產微生物活性制劑提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

出發菌株：筆者所在課題組從連云港海域海泥、蛤池泥、日照多島海海泥等樣品中分離21株放線菌，并保存于淮海工學院微生物實驗室。

病原指示菌：凡隆氣單胞菌溫和生物型（Aeromonas veronii biovar sobria）NQ菌株（由江蘇海洋大學海洋生命與水產學院秦蕾博士提供）。

1.1.2 培養基

病原指示菌培養基（TSA培養基）：胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂粉15.0～20.0 g，K2HPO4 2.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

放線菌斜面培養基（海水高氏1號）：可溶性淀粉20.0 g，KNO3 1.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，MgSO4 0.5 g，瓊脂粉15.0～20.0 g，陳海水1 000 mL，pH值7.2～7.4。

放線菌發酵培養基：葡萄糖20.0 g，黃豆粉 20.0 g，淀粉10.0 g，（NH4）2SO4 2.5 g，蛋白胨 5.0 g，玉米漿2.5 g，MgSO4.7H2O 0.25 g，K2HPO4 0.02 g，NaCl 4.0 g，CaCO3 6.0 g，陳海水1 000 mL，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 拮抗凡隆氣單胞菌NQ菌株的放線菌株篩選

（1）試驗菌無菌濾液制備：在容量100 mL三角燒瓶內裝量30 mL的放線菌發酵培養基中，無菌操作接入活化斜面菌種1～2環，20 ℃、180 r/min振蕩培養96 h，得發酵液;將發酵液經10 000 r/min、5 min 離心，上清液再經0.22 μm無菌濾膜過濾，得無菌濾液備用。

（2）病原指示菌的制備：用無菌生理鹽水配制濃度為107 CFU/mL的指示菌菌懸液備用。

（3）雙層平板牛津杯篩選法：制備底層為10 mL 2%的水瓊脂培養基，上層為7 mL TSA培養基的雙層平板，取病原指示菌懸液100 μL涂布，然后在平板上放入牛津杯;在牛津杯中加入10 μL試驗菌無菌濾液，每菌做3個平行，28 ℃培養24 h，測抑菌圈直徑。

1.2.2 菌株AC08F5的初步鑒定

1.2.2.1 形態特征觀察[14]

用扦片法培養，并在顯微鏡下觀察菌絲、孢子絲和孢子等的形態。

1.2.2.2 培養特征

采用蒸餾水和陳海水分別配制葡萄糖天門冬素瓊脂、高氏一號、察氏培養基、淀粉瓊脂、葡萄糖酵母膏瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂6種培養基制成平板。將菌株AC08F5三區劃線接種上述6種不同的鑒定培養基上。然后在20 ℃恒溫培養箱中培養7、14、30 d，對氣生菌絲的顏色、基內菌絲的顏色、生長狀況、有無可溶性色素產生及產生可溶性色素的顏色進行觀察記錄。

1.2.2.3 部分生理生化反應

采用細菌微量生化反應管（購自北京陸橋生物），每管中接入50 μL對數期菌株懸液，置于20 ℃恒溫培養箱培養，對照說明書觀察并記錄和判斷結果。

1.2.3 菌株AC08F5的16S rRNA PCR擴增與測序

按照文獻[15-16]提取菌株基因組，然后用細菌16S rDNA通用引物，正向引物5′-[JP9]AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′（E. coli 8 to 27），反向引物5′-[JP9]TACCTTGTTACGACTT-3′（E. coli 1507 to 1492）進行PCR擴增;PCR產物用UNIQ-10柱式微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（購自上海生工）提純后送上海生物工程技術服務公司雙向測序;將所測定序列通過NCBI中Nucleotide-nucleotide BLAST程序比對，并下載與試驗菌株親緣關系較近并已經確證的序列，用Clustal X軟件進行比對分析和MEGA 4軟件構建系統進化樹。

1.2.4 菌株AC08F5發酵清液中抑菌活性物質的穩定性研究

1.2.4.1 發酵清液的制備

將放線菌新鮮成熟孢子接種于發酵培養基中，20 ℃ 180 r/min恒溫振蕩培養96 h。在冷凍離心機將發酵液在4 ℃、10 000 r/min，離心5 min，離心上清液再經0.22 μm無菌濾膜過濾，得到發酵上清液備用。

1.2.4.2 熱穩定性

各取發酵上清液3 mL于24個試管內，每組3支試管分別置于20、30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴60 min，然后冰水中迅速冷卻，采用雙層平板牛津杯法測定各處理樣的抑菌活性，以 20 ℃ 下的抑菌活性作為100%進行相對活性比較。

1.2.4.3 pH穩定性

取發酵上清液5 mL于21個25 mL小燒杯中，采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將各燒杯中發酵液pH值分別調節至2、4、6、7、8、10、12，每個pH值設3個平行，室溫下放置 24 h，期間定時混勻幾次，再全部調回中性。用雙層平板牛津杯法測抑菌活性，并以pH值為7時的抑菌活性作為100%。

1.2.4.4 紫外照射穩定性

分別取5 mL發酵上清液于21個直徑90 mm平皿里，在超凈工作臺內，敞口放置于紫外燈（20 W）下，距離30 cm處照射0、5、10、15、30、45、60 min后取出，采用雙層平板牛津杯法測抑菌活性，以照射0 min的抑菌活性作為100%。

2 結果與分析

2.1 21株海洋放線菌對凡隆氣單胞菌抑制效果

由表1可知，有18株海洋放線菌對凡隆氣單胞菌有抑菌效果，其中以AC08F5抑菌圈最大，其抑菌直徑達（18±0.4） mm，表明菌株AC08F5的胞外代謝產物對病原指示菌凡隆氣單胞菌NQ菌株有較強的抑制作用。

2.2 AC08F5菌株分類地位的鑒定

2.2.1 形態特征

菌株AC08F5用扦片法培養后，觀察其氣生菌絲、孢子和孢子絲形態，在1 000倍油鏡下，氣絲呈現如樹枝直或者彎曲狀、孢子絲短、孢子鏈生成串（圖1），這些是鏈霉菌屬[17-18]的一些典型特點，因此，通過顯微觀察可以初步判斷菌株AC08F5屬鏈霉菌。

2.2.2 培養特征

放線菌菌株在不同的菌種鑒定培養基上會表現出不同的培養特征，其氣生菌絲、基內菌絲、有無可溶性色素產生及生長狀況均有一定差異。由表2可見，菌株AC08F5在蒸餾水培養基上培養和在陳海水培養基上培養的氣生菌絲、基內菌絲和可溶性色素有一定的差別，而且海水培養基上的生長狀況總體上也稍好，說明海水中所含的礦物質對菌株AC08F5的菌絲生長和可溶性色素有一定的影響。而且菌株AC08F5在高氏一號培養基上生長良好，菌絲呈細粉狀，結合“2.2.1”節顯微觀察結果，也符合鏈霉菌屬的特點。

2.2.3 生理生化反應

由表3可知，菌株AC08F5能夠產生蛋白酶液化明膠，能使淀粉水解，能夠產生硫化氫，不產生纖維素酶。同時，試驗考慮到菌株來源于海洋，所以還添加了無鹽胰胨水和3.5% NaCl胰胨水反應，以考察菌株是否嚴格需鹽菌，結果顯示菌株在無鹽和3.5% NaCl下都生長。這說明菌株AC08F5并非嚴格意義的專性海洋菌，為將來的菌種應用于淡水養殖也提供了可能。

2.2.4 AC08F5菌株的DNA測序

將菌株AC08F5的16S rDNA雙向測通后拼裝得序列共1 396 bp，提交GenBank，檢索號為MK 396649，并進行序列比對分析，采用ClustalX和MEGA軟件對菌株測序結果進行系統進化分析并作進化樹，由圖2可知，菌株歸屬鏈霉菌屬，最近緣的為Streptomyces griseoplanus（strain M42）、Streptomyces cavourensis subsp.（strain NBRC15391）、Streptomyces nitrosporeus（strain 126186），難以確切的分類到具體的種，所以目前將其命名為Streptomyces sp. strain AC08F5。

2.3 菌株AC08F5發酵清液中抑菌活性物質穩定性

2.3.1 熱穩定性

由圖3可知，在70 ℃以下處理后菌株AC08F5所產生的抑菌活性受溫度影響變化不大，70 ℃處理60 min可保留抑菌活性約77%，但當溫度超過80 ℃處理，抑菌活性受溫度影響較大，90 ℃處理的相對活性僅有40%，說明溫度在70 ℃以下條件，抗菌活性物質是相對穩定的，而高溫易導致發酵液抑菌活性喪失。

2.3.2 酸堿穩定性分析

由圖4可知，發酵液清液在pH值為4和10時，其相對抑菌相對活性分別為66.6%和72.1%，而當pH值為2～<4和pH值為10～<12時，發酵液中的活性物質的活性下降迅速，在pH=2、pH=12時，其相對活性只保存約20%～30%，結果說明強酸強堿容易導致發酵液抑菌活性物質失活。

2.3.3 紫外照射穩定性

由圖5可知，菌株AC08F5代謝產生的抑菌活性物質在試驗設定的紫外燈照射條件下，保持60 min，其相對抑菌活性仍能夠保持80%以上，初步說明該菌株所產生的抑菌活性物質在紫外燈照射下有較強的穩定性。

3 討論

通過篩選試驗從21株海洋放線菌菌株中，發現18株對病原指示菌凡隆氣單胞菌NQ菌株有抑菌效果，其中以菌株AC08F5抑菌活性最強，而且同課題組的研究發現該菌株對嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌均有一定的抑制作用，所以本試驗對菌株AC08F5作進一步的鑒定。放線菌的鑒定一般以《放線菌的分類和鑒定》為指導，綜合菌株的培養特征、顯微形態特征、生理生化反應以及16S rDNA基因序列來進行鑒定。本試驗中菌株AC08F5經鑒定屬鏈霉菌屬但未歸結到具體的種。Zheng等研究從臺灣海峽的海洋動植物表面、皮層以及腸道等分離的具有抗菌活性的放線菌的種屬分布情況，發現大多數具有抗菌活性的海洋放線菌為鏈霉菌屬[6]。事實上，更多研究報道也表明，研究的產生活性產物的海洋放線菌中鏈霉菌占多數[19]。

海洋環境的獨特性，使得海洋微生物能夠產生豐富的、結構新穎的活性天然產物，海洋放線菌雖不是海洋微生物中主要的區系，卻廣泛分布在海洋各種環境中，隨著研究的逐漸深入，海洋放線菌及其次級代謝產物已成為尋找新抗生素的重要來源[11]，具有非常重要的價值。而隨著科學的發展，分離純化方法的先進和鑒定技術的精準，從海洋放線菌分離得到的結構新穎的化合物越來越多，這些新化合物在抗菌、抗瘧、抗腫瘤和殺蟲等方面具有很好的活性[19]。本試驗對于菌株AC08F5代謝產物僅作了初步研究，表明發酵清液在70 ℃以下、pH值為4～10條件下，拮抗病原凡隆氣單胞菌的活性相對穩定，并對紫外燈照射穩定。但具體的拮抗病原凡隆氣單胞菌的活性物質為哪一類或哪幾類，以及該菌株的次級代謝產物的具體化學成分有待研究。

目前，考慮到放線菌應用與水產養殖業的主要作用機制是放線菌代謝所產生的各類抗生素抑菌和抗病，將海洋放線菌應用于防治水產病害研究相對還是較少，但已有諸多成功的先例，如You等[7-8]、Das等[9]、Kumer等[10]成功地將海洋放線菌應用到水產養殖中，分別用于治療和預防致病性弧菌引起的蝦病害[7-8]、作為益生菌應用于促進斑節對蝦（Penaeus monodon）的生長[9]和從海洋放線菌提取的抗菌物質混合飼料喂養凡納濱對蝦促進產生抗病毒效應[10];王勇分離獲得1株抗菌譜廣、活性較強的拮抗水產病原菌的海洋放線菌弗氏鏈霉菌DL-4菌株并對其抑菌活性物質進一步研究，為進一步應用于水產病害防治提供基礎[11]。水產微生物中出現大量抗生素耐藥類型是因為在水產養殖中大量使用合成的抗生素和藥物所造成的[1]，而直接使用放線菌作為益生菌，相對出現抗性基因橫向轉移機會低，值得在水產養殖中推廣應用[12]。目前，尚未見有將海洋放線菌用于防治凡隆氣單胞菌引起的病害的報道，對于筆者所在課題組分離自連云港海域高公島海底泥的放線菌菌株AC08F5能否真正在水產養殖中起到抗病防病的作用，以及是否會造成凡隆氣單胞菌等水產病原菌出現耐藥性等還有待研究。

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收 稿日期：2019-01-29

基金項目：江蘇省連云港市科技局農業攻關項目（編號：CN1407）;江蘇省連云港市科技局農業支撐項目（編號：KK15007）;江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室科研創新項目（編號：CXKT20180118）。

作者簡介：陳 靜（1973—），女，江蘇宿遷人，碩士，高級實驗師，主要從事海洋微生物及其活性物質研究。E-mail：chenj@hhit.edu.cn。