海鮮菇栽培料中細菌菌落結構及多樣性分析

徐兵 陸灝鈺 韋雪銘 張良 冀宏

摘要： 采用高通量測序技術研究海鮮菇栽培料中的細菌群落多樣性、微生物群落組成，結果表明，海鮮菇栽培料細菌16S rDNA的V3～V4區測序共獲得52 192條序列，10 588個OTU數目，栽培料中具有較多的微生物群落;群落中，變形菌門占92.71%，γ-變形菌綱占75.77%，假單胞菌目占69.76%，莫拉氏菌科占68.73%，不動桿菌屬占66.30%。

關鍵詞： 海鮮菇栽培料;微生物群落;多樣性;高通量測序;細菌

中圖分類號： S182? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0148-05

海鮮菇別稱真姬菇，在分類學上隸屬白蘑科玉蕈屬[1]，為藥食兩用菌，其營養豐富，味道鮮美，海鮮菇多糖具有提高免疫力、抗老化、降血脂等功效[2-3]。在海鮮菇工廠化生產中，栽培料的應用具有悠久的歷史[4]，其質量、數量直接關系到海鮮菇的產量、質量。栽培料主要營養提供者為農業廢棄物，發酵時間相對較長，需要3個月左右，對環境要求高，這就大大增加了海鮮菇工廠化生產的場地空間、人工成本，從而導致企業生產成本增加。有研究表明，栽培料在天然堆肥條件下，微生物菌落生長受溫度變化的影響較大[5-6]，研制出既適合海鮮菇生長，又能縮短堆料時間的菌劑顯得尤其重要，而開展海鮮菇栽培料中微生物群落研究具有更重要的意義[7-9]。目前，國內外對海鮮菇栽培料主要研究其配比優化，對海鮮菇栽培料細菌群落的研究鮮見報道。

高通量測序技術是目前相對比較成熟的檢測手段，被廣泛應用于微生物群落多樣性的研究。自2007年Orsouw等初次對玉米采用高通量測序技術進行測序[10]開始，便開啟了測序新世界的大門，2011年完成對橡膠樹、可可樹等多種植物的測序[11-12]。本研究利用高通量測序技術，分析海鮮菇栽培料中的微生物群落組成和多樣性，剖析各類微生物的數量比例，明確優勢菌群，了解優勢菌群在栽培料中的主要作用，為主動控制堆肥發酵過程、縮短堆料周期、減少企業生產成本、提高海鮮菇產量和質量提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 堆料3個月的海鮮菇栽培料，其配比為玉米芯3%、甘蔗渣3%、木屑3%、麥麩1%、豆粕0.5%、玉米粉0.5%、生石灰0.025%，由昆山正興食用菌有限公司提供。

1.1.2 試劑 DNA提取試劑盒E.Z.N.A.Soil DNA Kit，由OMEGA公司生產;Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒，由Life公司生產;2×Taq Master Mix，由Vazyme公司生產;MagicPure Size Selection DNA Beads，由Transgen公司生產。

1.1.3 儀器與設備 臺式離心機，由Thermo Fisher公司生產;混勻型干式恒溫器，由深圳拓能達科技有限公司生產;電泳儀、電泳槽，由北京六一儀器廠生產;凝膠成像系統，由UVP公司生產;Qubit3.0熒光計，由Invitrogen公司生產;PCR儀，由BIO-RAD生產;移液器，由Eppendorf公司生產。

1.2 測定內容與方法

1.2.1 理化指標 分別參照《食品安全國家標準 食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）、《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》（GB 5009.4—2016）、《食品安全國家標準 食品pH值的測定》（GB 5009.237—2016）、《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》（GB 5009.5—2016）、《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》（GB 5009.235—2016）測定海鮮菇栽培料的水分、灰分、pH值、蛋白質含量、氨基酸態氮含量。采用DNS法測定還原糖、總糖含量。

1.2.2 微生物指標 分別參照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2—2016）、《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》（GB 4789.3—2016）、《飼料中細菌總數的測定》（GB/T 13093—2006）測定海鮮菇栽培料中的菌落總數、大腸菌群數、細菌總數。

1.2.3 微生物多樣性

1.2.3.1 樣品處理 取栽培料原始樣品200 mg，放入無菌的2 mL EP管中，加入濃度為70%的乙醇1 mL，混合，振蕩;室溫10 000 r/min離心3 min，丟棄上漿;添加1×磷酸緩沖鹽溶液（PBS溶液），混勻，室溫10 000 r/min離心1 min，丟棄上層液體;倒置EP管在吸濕紙上1 min，直到沒有液體流出，將樣品管置于烘箱中55 ℃干燥10 min，使殘留乙醇完全揮發。

1.2.3.2 DNA提取和PCR擴增 采用試劑盒提取海鮮菇栽培料中的細菌基因組DNA，提取的基因組DNA在細菌16S rDNA的V3～V4區進行2輪PCR擴增;待反應完全結束，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，可得到清晰的條帶（圖1），DNA濃度達到擴增所需要求，可用于后續的研究分析。

1.2.3.3 測序數據處理優化 運用Qiime 1.8.0軟件過濾序列，去除3′端的引物接頭、引物錯配比率>0.1的序列、樣本中序列尾部質量值<20的堿基、含N的序列、長度<200 bp的序列、嵌合體序列，使用Mothur 1.30.1軟件中的Uchime去除嵌合體序列。

1.2.3.4 多樣性分析 采用Usearch 5.2.236軟件對97%相似水平下的操作分類單元（OTU）進行聚類分析，選擇豐度最高的序列作為OTU代表性序列;采用Mothur 1.30.1軟件分析得出Shannon指數、Simpson指數、Coverage指數等群落分布多樣性指數及Chao1指數、ACE指數等群落分布豐度指數。

1.2.3.5 群落結構分析 采用序列比對分析軟件Blastn工具將OTU序列與對應數據庫進行比對，篩選出OTU序列的最佳比對結果，并對比對結果進行過濾，獲得樣品在門、綱、目、科、屬不同分類水平上的分類學比對情況。

2 結果與分析

2.1 海鮮菇栽培料的理化性狀及微生物指標

試驗結果表明，海鮮菇栽培料中水分含量、灰分含量、pH值、蛋白質含量、氨基酸態氮含量、還原糖含量、總糖含量分別為60.27%、2.44%、7.20、3.98%、0.023%、0.18%、26.70%，菌落總數、細菌總數分別為1.3×107、1.2×108 CFU/g，大腸菌群未檢出。

2.2 海鮮菇栽培料中的微生物多樣性

試驗結果表明，從16S rDNA基因的V3～V4測序中獲得56 422個序列，平均長度為462.26 bp，質控后，共有52 192個序列，平均長度為424.26 bp;對97%相似水平下的序列進行OTU統計分析，共獲得10 588個OTU數;經軟件分析，ACE、Chao1、Shannon、Simpson、Coverage指數分別為480 779.61、151 060.50、4.59、0.10、0.81，說明栽培材料中微生物群落的多樣性、總體豐富程度相對較高[13]。

2.3 海鮮菇栽培料細菌群落在不同分類學上的分布

2.3.1 門、綱 試驗結果表明，海鮮菇栽培料中共鑒定出11個細菌門，主要的有變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）9個細菌門，占比分別為92.71%、3.63%、3.37%、0.19%、0.02%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%。由圖2可見，變形菌門中的γ-變形菌綱占比相對最高，為75.77%，是細菌的主要種類。

2.3.2 目、科 由圖3、圖4可見，海鮮菇栽培料中共鑒定出超過20種細菌目，其中，假單胞菌目 （Pseudomonadales）的比例相對最高，達到69.76%，而伯克氏菌目（Burkholderiales）、紅細菌目（Rhodobacterales）分別為11.57%、4.72%，說明從目水平上看，假單胞菌目最為占優;在科水平上，莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）分別屬于假單胞目、伯克氏菌目，所占比例分別為68.73%、11.46%，而紅細菌目中紅桿菌科（Rhodobacteraceae）僅為4.72%，說明莫拉氏菌科最為占優。

2.3.3? 屬 由圖5可見，海鮮菇栽培料中共鑒定獲得超過49個細菌屬，主要有不動桿菌屬（Acinetobacter）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、芽孢桿菌屬（Gemmobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas），占比分別為66.30%、9.56%、3.43%、2.99%、1.55%、1.49%，其中，不動桿菌屬最為占優。

3 結論與討論

食用菌栽培料中的含水量一般控制在60%～65%[14-15];灰分含量的高低會直接影響海鮮菇中礦物質含量的多少;pH值偏低，拌料操作中往往加入1%的石灰來調控[16]，pH值偏高，可以在栽培料中添加含氮量較高的物質。本試驗結果表明，海鮮菇栽培料中的水分含量、灰分含量、pH值分別為60.27%、2.44%、7.20，滿足海鮮菇工廠化生產的需求。栽培料中微生物生長有一部分是依靠其分解栽培料中的糖，糖含量高低至關重要，而發酵時間越長，糖含量會越少，因此，在早期發酵階段，應盡可能滿足微生物的生長需求，使其充分發酵[17-18]。本試驗結果表明，海鮮菇栽培料中蛋白質含量、氨基酸態氮含量、還原糖含量、總糖含量分別為3.98%、0.023%、0.18%、26.70%，能較好滿足海鮮菇生長對養分的需求。

海鮮菇生長所需養料是靠微生物分解栽培料中的營養物質獲得，微生物扮演著重要的角色。γ-變形菌亞群在變形菌門中是重要的菌群，而變形菌門是革蘭氏陰性菌的主要組成部分[19]。Peters等分析由玉米秸稈、木屑組成的堆肥材料中的細菌群落發現，其中存在大量的γ-變形菌亞群[20]。假單胞菌目在栽培料發酵過程中對加快腐熟發揮著重要的作用，王勝認為，一個好的腐熟環境可以加快碳、氮、磷、鉀、硫等分解而被植物吸收，并在秸稈腐熟中加入沼澤紅假單胞菌以創造好的發酵環境[21]。不動桿菌是兼性厭氧菌，能降解纖維素，在自然發酵過程中，栽培料中的氧含量會相對較低，對不動桿菌而言可提高堆肥中纖維素的分解效率[22-23]。本試驗采用高通量測序、微生物多樣性檢測技術分析海鮮菇栽培料中的細菌群落結構和多樣性，結果表明，共獲得52 192條序列，10 588個OTU數;栽培料中共鑒定得到細菌菌落11個門、20個目、49個屬，栽培料中的優勢菌群分別是變形菌門、γ-變形菌綱、假單胞菌目、莫拉氏菌科、不動桿菌屬，其相應占比分別為92.71%、75.77%、69.76%、68.73%、66.30%，說明栽培料中菌群有較好的多樣性和豐度，對海鮮菇生長十分有利。

須補充的是，本次試驗中未檢出大腸桿菌，說明海鮮菇栽培料被糞便污染的可能性很小，存在腸道病原微生物的可能性微乎其微，這在一定程度上減少了不利菌群對栽培材料潛在的危害。

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收 稿日期：2019-02-26

基金項目：江蘇省蘇州市農業科技創新項目（編號：SNG2017066）。

作者簡介：徐 兵（1982—），男，江蘇常熟人，碩士，實驗師，從事微生物學研究。E-mail：xubing@cslg.cn。

通信作者：冀 宏，博士，教授，從事食、藥用菌研究。E-mail：595827676@qq.com。