γ-聚谷氨酸對6種植物病原真菌的室內毒力測定

汪少麗 王英姿 王洪濤 劉保友 史大臣

摘要： 用不同濃度的γ-聚谷氨酸對6種植物病原菌（葡萄白腐病菌、櫻桃莖腐病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌）的抑菌效果和毒力進行測定。結果表明，在16.67 g/L質量濃度下，γ-聚谷氨酸對葡萄白腐病菌的相對抑制率最高，為73.10%，其次是對櫻桃莖腐病菌的相對抑制率為63.09%，而對小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌的相對抑制率則較低，分別為39.18%、33.16%、32.64%、24.54%。毒力測定發現，γ- 聚谷氨酸對葡萄白腐病菌的毒力最強，EC50為12.803 0 g/L，其次是對于櫻桃莖腐病菌、花生褐斑病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌的毒力，其EC50分別為13.624 1、18.336 0、18.773 5、23.600 7 g/L，對蘋果輪紋病菌的毒力最弱，其EC50為34.490 3 g/L。

關鍵詞： γ-聚谷氨酸;植物病原真菌;菌絲生長法;相對抑制率;室內毒力測定

中圖分類號： S432.4+4? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0110-03

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，簡稱γ-PGA）是一類由芽孢桿菌發酵產生的胞外多肽，最早于1937年被發現，存在于炭疽芽孢桿菌的外莢膜中[1]，1942年Bovarnick發現，枯草芽孢桿菌也能夠產生γ-聚谷氨酸[2]。γ-聚谷氨酸作為一種新型可生物降解的水溶性高分子材料[3]，已被廣泛應用于農業、醫藥、化工、污水處理等領域[4-7]，是一種具有極大開發價值和應用前景的新型多功能生物制品。

近年來，γ-聚谷氨酸及其衍生物在農業中得到越來越多的應用，尤其在土壤和肥料等方面發展迅速。如張新民等研究發現，γ-聚谷氨酸是一種優良的土壤保水劑[8];汪家銘發現，γ-聚谷氨酸不僅能夠提高肥料的利用率，還能夠延長肥料在土壤中的釋放周期[9]。但目前關于γ-聚谷氨酸對農作物病原真菌的作用研究卻鮮有報道。本研究選擇6種主要植物病原真菌（葡萄白腐病菌、櫻桃莖腐病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌）進行γ-聚谷氨酸的抑菌試驗，分別測定γ-聚谷氨酸對這6種病原真菌的毒力，旨在為進一步研究γ-聚谷氨酸抑制病原真菌機制提供理論基礎，同時，也為γ-聚谷氨酸應用于農作物病原真菌的田間防治提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑

γ-聚谷氨酸由煙臺市佳益有機肥料有限公司提供，由芽孢桿菌發酵產生。

1.1.2 供試菌種

供試菌種主要有葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）、櫻桃莖腐病菌（Phytophthora nicotianae）、小麥紋枯病菌（Rhizotonia cerealis）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、花生褐斑病菌（Cercospora arachidicola Hori）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea），均由山東省煙臺市農業科學研究院提供，經活化培養后保存在4 ℃冰箱，所用培養基為常規PDA培養基。

1.2 試驗方法

供試藥劑對病原菌的毒力測定采用菌絲生長速率法。將供試藥劑γ-聚谷氨酸加入到融化的PDA培養基中，配制成5個不同質量濃度（6.67、8.30、10.00、12.50、16.67 g/L）的帶藥平板培養基，以無菌水作空白對照。在活化好的6種植物病原菌菌株的菌落邊緣用滅菌的打孔器打取直徑為 0.5 cm 的菌絲塊，分別移到帶藥平板培養基上，每處理設置5個重復。在25 ℃恒溫培養箱中培養 5～7 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落直徑平均值和菌絲生長抑制率。

抑制率=（對照組菌落直徑-0.5 cm）-（含藥組菌落直徑-0.5 cm） 對照組菌落直徑-0.5 cm×100%。

1.3 數據分析

將菌絲生長抑制率換算成機率值（y），藥劑濃度換算成質量濃度對數（x），按質量濃度對數與機率值回歸法求得線性回歸方程：y=a+bx，并以回歸方程計算γ-聚谷氨酸對6種植物病原菌的抑制中濃度（EC50）、機率值與質量濃度對數之間回歸的相關系數（r），數據利用Excel、DPS分析軟件進行方差分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 γ-聚谷氨酸對6種植物病原菌的抑制率

γ-聚谷氨酸的5個試驗質量濃度對葡萄白腐病菌、櫻桃莖腐病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌的菌絲生長均具有不同的抑制作用，菌落擴展直徑均小于對照。其中，γ-聚谷氨酸的質量濃度范圍為6.67～16.67 g/L時對葡萄白腐病菌的抑制作用最強，菌絲擴展直徑范圍為 1.77～5.15 cm，抑制率范圍為21.57%～73.10%;對櫻桃莖腐病菌的抑制作用次之，其菌絲擴展直徑范圍為2.70～7.08 cm，抑制率范圍為3.20%～63.09%，對于小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌的抑制作用則依次減弱，抑制率范圍分別為5.24%～39.18%、9.55%～33.16%、0.40%～32.64%、2.89%～24.54%（表1）。

2.2 γ-聚谷氨酸對不同病原菌的毒力測定

2.2.1 γ-聚谷氨酸對不同植物病原菌的抑制率中濃度比較

由表2可知，γ-聚谷氨酸對葡萄白腐病菌及櫻桃莖腐病菌的EC50較小，分別為 12.803 0、13.624 1 g/L，表現出較強的毒力，對花生褐斑病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌的毒力次之，其EC50分別為18.336 0、18.773 5、23.600 7 g/L，而對蘋果輪紋病菌的EC50最大，為34.490 3 g/L，表現出弱毒力。

2.2.2 γ-聚谷氨酸對6種植物病原菌的敏感性比較

殺菌劑室內毒力測定中EC50越小、斜率越大說明病原菌對藥劑的反應靈敏度越高，即隨著藥劑濃度的增加，抑制率明顯增大。但有研究表明，回歸方程的斜率與病原菌對殺菌劑的敏感性成正比[10-11]。本研究中γ-聚谷氨酸對葡萄白腐病菌、櫻桃莖腐病菌、花生褐斑病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、蘋果輪紋病菌的毒力回歸方程的斜率分別為3.609 7、6.093 6、6.075 2、3.282 2、2.368、2.859 9（圖1）。由此可見，供試藥劑回歸方程的斜率與病原菌對殺菌劑的敏感性非正相關，其原因還須后期田間試驗結果的驗證。

3 結論與討論

γ-聚谷氨酸作為一種芽孢桿菌代謝產物，不僅在農業肥料應用中具有良好效果，在殺蟲劑、除草劑、驅蟲劑等農藥中適量添加也能夠延長這些藥物在作物表面的停留時間，使作物葉片表面的農藥不容易因為干燥、下雨而流失，從而提高農藥作用效果[12]。但目前關于γ-聚谷氨酸對于植物病原真菌直接的生長抑制作用研究鮮有報道。王啟軍曾證實由枯草芽孢桿菌發酵產生的γ-聚谷氨酸對于玉米小斑病菌生長并無抑制效果[13]。劉俊研究發現，因為γ-聚谷氨酸具有很強的黏性，可以吸附大量的陽離子，從而增強生防菌菌體之間的聚集和吸附能力，增加植物的抗病性，但這些報道并未證實γ-聚谷氨酸對于病原真菌的菌絲生長具有抑制作用[14]。而本研究結果表明，γ-聚谷氨酸對6種不同植物病原真菌的菌絲生長具有不同的抑制作用，且對于不同植物病原真菌亦具有不同的毒力，其毒力由大到小排序為葡萄白腐病菌>櫻桃莖腐病菌>花生褐斑病菌>小麥紋枯病菌>黃瓜灰霉病菌>蘋果輪紋病菌，其中以γ-聚谷氨酸對葡萄白腐病菌的菌絲生長抑制作用最強，EC50為 12.803 0 g/L。但γ-聚谷氨酸對于不同病原真菌菌絲生長的具體是通過形成高分子膜包被菌絲從而抑制菌絲的延展還是通過對菌體細胞的直接破壞毒殺作用而完成的[15]，目前仍不清楚，這也是后期要進行深入探索研究的。

葡萄白腐病菌、櫻桃莖腐病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌是農業生產中的重要病害，對農作物產量和品質影響極大。目前對上述病害的防治仍以化學防治為主，但由于用藥不科學，多年持續使用單一藥劑，造成病原菌對一些殺菌劑已產生了不同程度的抗藥性[16-17]。因此，一些新型綠色生物農藥的研制對于防治上述病害迫在眉睫，γ-聚谷氨酸無污染、無殘留、無抗藥性，其對于植物病蟲害防治的研究已成為近年來的研究熱點，本研究結果為從芽孢桿菌發酵產物中提取γ-聚谷氨酸并將其作為新型農藥的應用提供了研究基礎。

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收 稿日期：2019-02-12

基金項目：山東省煙臺市科技計劃（編號：2017NC022）;山東省農業科學院農業科技創新工程（編號：CXGC2016B11）;山東省現代農業產業技術體系果品產業創新團隊病蟲防治與質量控制崗位專家專項（編號：SDAIT-06-11）。

作者簡介：汪少麗（1989—），女，山東煙臺人，博士，農藝師，主要從事植物病害防治及機理研究。Tel：（0535）6352015;E-mail：shaoliwang123@126.com。

通信作者：王英姿，研究員，碩士生導師，主要從事果樹、蔬菜植物保護等研究。Tel：（0535）6352015;E-mail：ytnkyzbs@yt.shandong.cn。