梁山慈竹SSR-PCR體系的優(yōu)化

王麗麗 孫昌法 胡尚連

摘要： 以梁山慈竹為材料，提取葉片DNA并將其作為模板，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化影響梁山慈竹簡(jiǎn)單重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（SSR-PCR）體系的3個(gè)主要因素，并對(duì)21個(gè)梁山慈竹不同品系進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證，結(jié)果表明，優(yōu)化的20 μL SSR-PCR反應(yīng)體系為2×Taq PCRMix 8 μL、模板DNA（20 ng/μL） 2.5μL 、SSR引物（1.0×10-4 mmol/L） 1 μL，無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)足至20 μL;使用SSR引物BMK.38757對(duì)21個(gè)梁山慈竹不同品系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小在 140 bp 左右，共有4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn);使用SSR引物L(fēng)6、R83對(duì)梁山慈竹進(jìn)行擴(kuò)增，均獲得3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，且條帶清晰。

關(guān)鍵詞： 梁山慈竹;簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）;正交試驗(yàn);優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S795.501? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）05-0061-04

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）別稱微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）[1]，由1～6個(gè)堿基重復(fù)串聯(lián)組成，其不同等位基因間的重復(fù)數(shù)具有豐富的差異，而其兩側(cè)的序列高度保守，可以在重復(fù)串聯(lián)序列的兩端設(shè)計(jì)引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度檢測(cè)等位基因的多態(tài)性。SSR是Skinner等于1974年在研究寄居蟹時(shí)首次發(fā)現(xiàn)的[2]，此后人們相繼發(fā)現(xiàn)，SSR廣泛存在于真核生物中，由于其具有多態(tài)性高、容易檢測(cè)、共顯性等特點(diǎn)，SSR標(biāo)記技術(shù)很快在動(dòng)植物遺傳檢測(cè)分析中得到廣泛應(yīng)用[3-4]。

SSR標(biāo)記根據(jù)開(kāi)發(fā)方法可分為基因組SSR（gSSR）、表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（EST-SSR）標(biāo)記，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相對(duì)價(jià)格越來(lái)越低，一些無(wú)參照基因組物種的EST-SSR開(kāi)發(fā)也越來(lái)越容易。西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室在梁山慈竹分子層面研究上取得一定進(jìn)展[5]，并獲得多個(gè)品系梁山慈竹的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[6-7]，這為梁山慈竹EST-SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在EST-SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)過(guò)程中，PCR過(guò)程對(duì)后續(xù)電泳條帶的讀取具有直接的影響[8]，為保證PCR結(jié)果的可靠性，本研究對(duì)影響梁山慈竹 SSR-PCR 結(jié)果的主要因子進(jìn)行優(yōu)化，以獲得較好的反應(yīng)體系，為后續(xù)梁山慈竹的遺傳多樣性、性狀關(guān)聯(lián)分析及分子輔助育種等研究奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

移液槍、PCR擴(kuò)增儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、垂直板電泳儀、凝膠成像儀、通風(fēng)櫥、離心機(jī)、數(shù)碼相機(jī)等。

1.2 試驗(yàn)材料

野生型梁山慈竹及梁山慈竹20個(gè)栽培品系葉片，由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 DNA提取及檢測(cè)

21個(gè)梁山慈竹品系的葉片基因DNA采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法進(jìn)行提取[9]，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度法分別檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量、濃度;分別取各品系DNA溶液10 μL，用蒸餾水稀釋至20 ng/μL后，在-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.4 SSR-PCR體系優(yōu)化

以野生型梁山慈竹葉片DNA為模板，使用SSR引物BMK.38757（表1），對(duì)影響SSR-PCR效果的Taq PCRMix用量、引物濃度、DNA模板用量采用3因素4水平正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，反應(yīng)總體積為20 μL，不足的加雙蒸水補(bǔ)齊。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，56 ℃下退火 30 s，72 ℃延伸25 s，32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 5 min;4 ℃ 保存。采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳2.5～3.0 h，電泳恒定電壓為600 V;使用ACS染液（2%硝酸銀，10%乙醇，0.5%冰醋酸）染色15～20 min，蒸餾水沖洗后，浸沒(méi)于由3%氫氧化鈉（NaOH）、0.1%甲醛配制成的顯影液中顯影約 15 min，至條帶清洗;采用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。

1.5 SSR-PCR反應(yīng)體系驗(yàn)證

以野生型梁山慈竹葉片DNA為對(duì)照（CK），以20個(gè)梁山慈竹品系葉片DNA為試驗(yàn)材料，以 BMK.38757、L6、R83為引物，分別在退化溫度為56、55、57 ℃，其他反應(yīng)程序同“1.4”節(jié)條件下對(duì)優(yōu)化的 SSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性及引物擴(kuò)增的多態(tài)性進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 梁山慈竹葉片DNA的提取與檢測(cè)

由圖1可見(jiàn)，21個(gè)梁山慈竹品系的葉片DNA電泳后均具有明亮的條帶，且條帶沒(méi)有明顯的拖尾。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示，各品系DNA在波長(zhǎng)分別為260、280 nm處的吸光度比值均在 1.7～1.9之間，DNA濃度均在200 ng/μL以上，說(shuō)明DNA降解較少，蛋白雜質(zhì)污染相對(duì)較輕，提取質(zhì)量較高，可滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 梁山慈竹SSR-PCR體系的優(yōu)化

由圖2可知，采用引物BMK.38757共擴(kuò)增出4條條帶;Taq PCRMix用量為10～12 μL（泳道9～泳道16）時(shí)，條帶染色過(guò)深，且容易出現(xiàn)引物二聚體;在Taq PCRMix用量相同條件（泳道1～泳道4）下，引物濃度或模板DNA用量的增加可以提升PCR的擴(kuò)增效果;泳道5～泳道8的條帶則進(jìn)一步表明，模板DNA用量的增加會(huì)使擴(kuò)增條帶逐漸清晰，而引物濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響相對(duì)較小。因此，優(yōu)化的梁山慈竹SSR-PCR體系為2×Taq PCRMix 8 μL，模板DNA用量（20 ng/μL）2.5 μL，SSR引物（1.0×10-4 mmol/L）1 μL，無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)足至20 μL。

2.3 梁山慈竹SSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系的驗(yàn)證

使用SSR引物BMK.38757，對(duì)野生型梁山慈竹及20個(gè)梁山慈竹栽培品系采用優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖3）顯示，共獲得4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，產(chǎn)物大小均在140 bp左右，條帶清晰，容易分辨，且均未見(jiàn)引物二聚體的產(chǎn)生。

圖4-（1）、圖4-（2）分別為采用引物L(fēng)6、引物R83在優(yōu)化體系下對(duì)部分梁山慈竹品系的PCR擴(kuò)增結(jié)果，結(jié)果表明，2個(gè)引物均可獲得3個(gè)等位多態(tài)性位點(diǎn)，說(shuō)明優(yōu)化體系能夠適用于多對(duì)引物，能夠得到清晰、無(wú)拖尾、易于讀取的條帶。

3 結(jié)論與討論

簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記由于具有共顯性、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、開(kāi)發(fā)容易且開(kāi)發(fā)時(shí)間短等特點(diǎn)[10]，自該技術(shù)誕生以來(lái)，得到廣大科研工作者的青睞，目前該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、目標(biāo)基因定位、品種鑒定及輔助育種等研究[11-16]中。由于竹類植物以無(wú)性繁殖為主，其遺傳多樣性分析、分類等分子水平上的研究難度較大[17]，因此，將SSR分子標(biāo)記手段應(yīng)用在竹類植物研究上具有重要的意義。

SSR分子標(biāo)記的技術(shù)基礎(chǔ)是PCR擴(kuò)增，影響PCR擴(kuò)增的因素將直接影響SSR分子標(biāo)記的結(jié)果。本研究對(duì)梁山慈竹SSR-PCR的引物濃度、模板DNA濃度、Taq PCRMix等設(shè)計(jì)3因素4水平正交試驗(yàn)，獲得的最佳反應(yīng)體系為T(mén)aq PCRMix 8 μL，模板DNA（20 ng/μL）2.5 μL，SSR引物（1.0×10-4 mmol/L） 1 μL，無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)足至20 μL。

采用優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)野生型梁山慈竹及20個(gè)梁山慈竹栽培品系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，部分引物獲得較好的多態(tài)性位點(diǎn)，其中，引物BMK.38757獲得4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，引物L(fēng)6、R83均可獲得3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（EST-SSR）標(biāo)記可用于梁山慈竹不同栽培品種間的遺傳分析，結(jié)合性狀關(guān)聯(lián)分析[18-19]能夠應(yīng)用于優(yōu)良竹種選育與鑒別，有利于加快育種速度。

參考文獻(xiàn)：

[1]郭小平，趙元明，劉毓俠. SSR技術(shù)及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1998，13（3）：73-76.

[2]Skinner D M，Beattie W G，Blattner F R，et al. The repeat sequence of a hermit crab satellite deoxyribonucleic acid is（-T-A-G-G-）n-（-A-T-C-C-）n[J]. Biochemistry，1974，13（19）：3930-3937.

[3]Ali S，Müller C R，Epplen J T. DNA finger printing by oligonucleotide probes specific for simple repeats[J]. Human Genetics，1986，74（3）：239-243.

[4]吳妙丹. 毛竹EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和利用[D]. 杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2010.

[5]李曉瑞，胡尚連，曹 穎，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)慈竹[STBX]4CL[STBZ]基因遺傳轉(zhuǎn)化梁山慈竹[J]. 林業(yè)科學(xué)，2012，48（3）：38-44.

[6]周振華. 梁山慈竹體細(xì)胞突變體No.29特性及其轉(zhuǎn)錄組分析[D]. 綿陽(yáng)：西南科技大學(xué)，2015.

[7]王身昌. 梁山慈竹體細(xì)胞突變體No.30的研究[D]. 綿陽(yáng)：西南科技大學(xué)，2016.

[8]楊傳平，王艷敏，魏志剛. 利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化白樺的SSR-PCR反應(yīng)體系[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，34（6）：1-3.

[9]閆慶祥，黃東益，李開(kāi)綿，等. 利用改良CTAB法提取木薯基因組DNA[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（4）：30-32.

[10]董文娟. 毛竹多拷貝SSR及其遺傳多樣性研究[D]. 杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2011.

[11]Lokko Y，Dixon A，Offei S，et al. Assessment of genetic diversity among African cassava Manihot esculenta Grantz accessions resistant to the cassava mosaic virus disease using SSR markers[J]. Genetic Resources & Crop Evolution，2006，53（7）：1441-1453.

[12]榮 浩，黃 彬，周 琦，等. 61個(gè)觀賞海棠品種的SSR指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，42（3）：045-050.

[13]Tsukazaki H，Yamashita K I，Yaguchi S，et al. Construction of SSR-based chromosome map in bunching onion（Allium fistulosum）[J]. Theoretical & Applied Genetics，2008，117（8）：1213-1223.

[14]Riday H，Brummer E C，Campbell T A，et al. Comparisons of genetic and morphological distance with heterosis between Medicago sativa subsp.sativa and subsp.falcata[J]. Euphytica，2003，131（1）：37-45.

[15]Hir Y P. 基于SSR和AFLP標(biāo)記的東方百合群體遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2016.

[16]Grandon N G，Alarcon Y，Moreno M V，et al. Genetic diversity among alfalfa genotypes （Medicago sativa L.） of non-dormant cultivars using SSR markers and agronomic traits[J]. Revista de la Facultad de Ciencias Agrarias，2013，45（2）：181-195.

[17]吳妙丹. 毛竹EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和利用[D]. 杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2010.

[18]李昌榮. 大花序桉生長(zhǎng)和材性遺傳變異及SSR關(guān)聯(lián)分析[D]. 北京：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，2017.

[19]譚文麗. 木薯SSR標(biāo)記與表型的關(guān)聯(lián)分析[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

收 稿日期：2019-02-12

基金項(xiàng)目：四川省“十三五”重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：2016NYZ0038）。

作者簡(jiǎn)介：王麗麗（1992—），女，山東臨沂人，碩士，從事植物遺傳與品種改良。E-mail：1298901076@qq.com。

通信作者：胡尚連，博士，教授，從事植物生理與生物技術(shù)研究。E-mail：hashanglian@126.com。