基于醇溶蛋白的木蘭科植物鑒定技術研究

葉珊珊　王楠　高艷芳　唐密　劉夢齡　肖強

摘要：木蘭科（Magnoliaceae）植物分布范圍廣且屬種多樣，屬種之間形態結構差異存在許多過渡類型，在屬與種之間的鑒定上存在很多爭議。目前，對于木蘭科植物種子分類和鑒定研究中，通常以植物學形狀特征作為鑒定方法。為了探索對木蘭科植物種子進行鑒別的有效途徑，采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳對10種木蘭科植物種子醇溶蛋白進行分析。結果發現，10種木蘭科植物共分離出61條譜帶，條帶數大多在6～7，最多為9條，最少的6條。利用Quantityone軟件對電泳譜帶進行分析，發現不同種之間譜帶都存在差異性，可以通過種子醇溶蛋白譜帶進行木蘭科植物物種鑒別。

關鍵詞：木蘭科（Magnoliaceae）;醇溶蛋白;聚丙烯酰胺凝膠電泳

中圖分類號：Q94? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）02-0098-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.020? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the identification of Magnoliaceae plants based on the alcohol-soluble protein

YE Shan-shana，WANG Nana，GAO Yan-fangb，TANG Mia，LIU Meng-linga，XIAO Qianga

（a.Hubei key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization;

b.School of Forestry and Horticulture，Hubei Minzu University，Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract： The Magnoliaceae plants are widely distributed and varied in genus and species. There are many controversies in the identification of genus and species because many transitional types were found among different genus and species. At present， botanical shape characteristics are usually used as identification methods for the classification and identification of magnoliaceae plants. In order to further identify the magnolia plants， the acid polyacrylamide gel electrophoresis was used to analyze the gliadin of magnolia plants. The results showed that 61 bands were separated from 10 species of magnolia，and most of the bands were between 6 and 7， with a maximum of 9， and the lowest 6. Using Quantityone software to analyze electrophoresis bands， it is found that there are differences between different bands， and species identification can be carried out through spectral bands.

Key words： Magnoliaceae; gliadin; polyacrylamide gel electrophoresis

木蘭科（Magnoliaceae）是被子植物系統發育過程中較原始的科，多為常綠性，是集綠化、觀賞、材用、藥用、科研等多種功能于一體的優良樹種[1，2]。木蘭科植物分類在植物學界長期以來存在較多爭論;在分類學研究中，一般采用的方法有形態學、解剖學、孢粉學、細胞學、胚胎學、植物化學、分子生物學、遺傳學等，而形態學研究是系統分類學研究的主要內容。在形態學研究中，一般通過觀察木蘭科植物的外在特征進行鑒別，并對其莖、葉、花、果實、種子等器官進行詳細的形態解剖[2]。木蘭科植物種子外形極其相似，其種子的種皮分3層，外種皮是顏色鮮艷的革質層，中種皮是油質的肉質層，最內一層是堅硬、骨質的內種皮[3];其紅色假種皮富含油細胞，當洗去紅色假種皮后，常常會在堅硬的骨質內種皮表面發現一層油脂[4]。徐鳳霞等[5]在解剖鏡下觀察了10屬52種木蘭科植物種子內種皮合點區形態，發現可分為孔型和管型兩大類型，并將其運用到木蘭科植物屬種的分類上[2];由于存在多種不同種類木蘭科植物種子合點區形態相似的情形，因此，采用這種方式鑒定所需時間較長，對鑒定者要求較高。探索一種在園林育種中對木蘭科植物種子進行有效鑒定的可靠方法具有重要的實踐價值。

醇溶蛋白是種子的一類貯藏蛋白，一般不受種植環境的影響，而與其遺傳特性有關，既可用來區分具有遺傳差異的品種（品系），又能反映出品種（品系）間的親緣關系，通過醇溶蛋白來進行不同種類植物鑒別得到廣泛應用。國內外許多研究學者采用醇溶蛋白電泳方法對大米[6]、燕麥[7，8]、蕎麥[8]、意大利小米[9]、日本稗子[10]等進行了鑒別研究，取得了較好效果。但將此方法用于木本植物種屬鑒別研究的報道較少[11，12]，鑒于通過形態學方法鑒別木蘭科植物存在困難，本研究嘗試利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析木蘭科植物種子醇溶蛋白特征譜帶，以達到鑒別木蘭科不同種類植物的目的。

1? 材料與方法

1.1? 材料

成熟晾干的木蘭科木蘭屬、玉蘭屬、木蓮屬、含笑屬植物種子，由恩施冬升植物開發有限責任公司提供。各供試材料名稱具體見表1。

1.2? 試驗方法

將供試種子去種皮，稱取0.2 g，加入1.2 mL的樣品提取緩沖液（含25% 2-氯乙醇、12%尿素和1% 2-巰基乙醇）。充分研磨，轉入2 mL的離心管，振蕩10 min，然后在12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液。在上清液中加入等量的40%蔗糖溶液和適量1%的甲基綠溶液，振蕩混勻，在12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液，即為電泳上樣液，4 ℃冰箱保存待用。

參照Bushuk等[13]的方法進行乳酸鋁酸性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，并稍加修改。醇溶蛋白固定、染色、脫色參照孫克江等[14]的方法，將剝離的凝膠浸入固定液中，室溫下固定0.5 h，倒掉固定液，隨后加入考馬斯亮藍染色液染色2 h，取出凝膠，用去離子水洗去凝膠表面附著的染料，脫色液漂洗數次，直至譜帶背景清晰。采用GEI mage scanner III圖像掃描系統中反射稿模式快速掃描染色后的凝膠，記錄蛋白譜帶。采用Quantity one軟件測定酶譜帶的相對遷移率（Relative mobilities，Rf）。采用指紋圖譜分析軟件Cross Checker對10種木蘭科植物種子醇溶蛋白電泳圖進行統計;在Rf值相同的位置，如果有醇溶蛋白譜帶，則記為1，無酶譜帶記為0，建立0和1的二元數據矩陣。Rf=蛋白質譜帶遷移距離/前沿指示劑遷移距離。

2? 結果與分析

2.1? 木蘭科植物醇溶蛋白譜型分析

采用乳酸鋁酸性電泳對10種木蘭科植物種子中醇溶蛋白進行分離，發現不同種間醇溶蛋白譜型均有明顯差異（圖1）。10種木蘭科種子蛋白譜帶基本上呈現出泳道中部染色強度較上、下部大的特點， 表明這10種木蘭科植物具有相似的遺傳基礎。蛋白譜表型經Quantity one軟件分析表明，10種木蘭科植物種子醇溶蛋白譜帶的類型共計61種，各木蘭科植物平均譜帶數在6～7條，其中木蓮屬毛果木蓮條帶數最多，有9條。

2.2? 木蘭科植物醇溶蛋白譜親緣分析

為進一步了解10種木蘭科植物間的親緣關系，以Nei氏遺傳距離（表2）為基礎數據進行分析，發現馨香玉蘭和大葉玉蘭親緣關系最近，遺傳距離為0.38;大葉玉蘭和毛果木蓮親緣關系最遠，其遺傳距離可達0.53。

3? 小結與討論

醇溶蛋白電泳方法具有簡單快速、重復性好、準確可靠、低成本等特點，目前國內外廣泛應用于品種鑒定，可作為首選檢驗方法，滿足種子檢驗數量大、品種多的需求[15]。20世紀80年代就已經利用醇溶蛋白對水稻品種進行鑒定[16];1989年中國更是把利用醇溶蛋白鑒定小麥和大麥種子的方法作為一種標準程序[17]。醇溶蛋白在植物品種的鑒定上具有重要價值。

木蘭科植物鑒定的方法多樣，可以通過采集樣本與已有標本進行比對，還可以研究種子差異或利用分子生物學方法對木蘭科植物進行鑒定。1996年，徐鳳霞等[5]提出利用木蘭科種子的內種皮在合點區的特殊結構來鑒別木蘭科種子。2005年，夏國華等[1]提出利用觀察種子形態的方法鑒別木蘭科不同屬的種子，并整理出種子形態特征分屬檢索表。2013年，李劍等[18]利用ISSR和AFLP兩種分子標記方法對木蘭科植物進行研究，發現木蘭屬和含笑屬聚類在一起，其差異可以用分子標記鑒定出來。2017年，薛曉明等[19]利用電鏡掃描的方法對木蘭科7種植物花粉進行研究，通過花粉形態上的差異對木蘭科植物進行鑒定。在木蘭科植物鑒定上，植物形態學鑒定難以用肉眼分辨，難度較大。而分子標記雖然結果較精確，但成本和試驗條件要求較高，無法廣泛推廣使用。種子貯藏蛋白的組成由遺傳物質決定，不受環境影響，其組成的差異可以反映基因型的不同，一個品種通常只有一種蛋白質的電泳圖譜[13，14]。因此，利用醇溶蛋白電泳技術對木蘭科植物種子進行鑒定是可行的。

醇溶蛋白的提取技術極其重要，它將影響整個電泳過程的成功與否。醇溶蛋白屬于一類貯存蛋白，存在于谷物的淀粉胚乳層中，具有特殊的溶解性質。它不溶于充分稀釋的鹽溶液，可由乙醇-水混合溶液進行提取，但有些蛋白質在這種條件下是不能溶解的。主要是因為醇溶蛋白間或其他蛋白質之間存在共價連接。所以為了提取成功還要加某些還原性試劑來破壞這些共價鍵[20]。對于醇溶蛋白的提取前人做了許多研究，例如在小麥醇溶蛋白提取方面，顏啟傳等[17]提取小麥中的醇溶蛋白時使用甲基綠粉劑和2-氯乙醇進行提取，采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術進行分離;邵錦震等[21]利用由2-氯乙醇和2-巰基乙醇組成的復合提取劑取得了較好的提取效果。在高粱醇溶蛋白提取方面，王偉等[22]研究表明，根據蛋白濃度測定和二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結果顯示，還原劑二硫蘇糖醇（DDT）濃度為4%的60%叔丁醇溶液，樣品質量比提取劑用量為1∶8（g/mL）是提取高粱種子醇溶蛋白的最佳條件。對油松種子中醇溶蛋白提取及酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳（A-PAGE）分析表明，由1% 2-巰基乙醇和12%尿素組成的復合提取劑提取效果最佳，其次是由20% 2-氯乙醇、1% 2-巰基乙醇和12%尿素組成的復合提取劑[11]。

在木蘭科植物種子中醇溶蛋白提取中，筆者采用了多種方法提取，其中效果最佳的是由25% 2-氯乙醇、1% 2-巰基乙醇和12%尿素組成的復合提取液。在聚丙烯酰胺凝膠電泳方法上，先后采用SDS-PAGE和A-PAGE電泳技術，經過多次試驗，A-PAGE方案效果最佳，圖譜中條帶豐富，帶型清晰度高。本研究建立的A-PAGE分析木蘭科植物種子中醇溶蛋白質方法具有快速、準確、靈敏等優勢，在鑒別木蘭科不同種植物種子方面具有較高可行性。但由于收集到的品種有限，尚需進一步研究該方法對更多木蘭科種子的適用性，以建立木蘭科植物種子醇溶蛋白指紋圖譜，為園林育種工作提供快速有效的指導。此外，利用該方法對木蘭科植物系統進化研究，也是值得進一步嘗試的領域。

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收稿日期：2019-04-20

基金項目：國家自然科學基金項目（31260057;31460203）;湖北省大學生創新創業訓練計劃項目（201710517038;201810517051）

作者簡介：葉珊珊（1997-），女，廣西桂林人，在讀本科生，研究方向為植物生物化學與分子生物學，（電話）16677160687（電子信箱）

1271271042@qq.com;通信作者，肖? 強，男，教授，主要從事植物生物化學與分子生物學研究，（電子信箱）275975926@qq.com。