Cep164基因對CP110在中心粒上表達的影響

王春花

摘要：Cep164基因是參與纖毛形成的重要基因之一，為研究Cep164基因與CP110的關系，探討CP110在Cep164調節纖毛形成中的作用，通過免疫熒光染色與Western印跡法確定Cep164基因缺失時CP110基因的表達情況，利用免疫共沉淀法確認Cep164與CP110蛋白相互作用的關系。結果表明，Cep164基因的缺失導致CP110表達增高，Cep164與CP110蛋白無直接相互作用關系，Cep164是通過間接方式調控CP110在細胞內表達，CP110降解失敗可能為Cep164基因缺失導致纖毛生成障礙的原因之一。

關鍵詞：Cep164基因;CP110基因;中心粒

中圖分類號：Q132.7? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）02-0166-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.037? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

The Cep164 gene indirectly regulate CP110 expression in the centriole

WANG Chun-hua

（School of Life Science and Technology，Mudajiang Normal University，Mudanjiang 157000，Heilongjiang，China）

Abstract： Cep164 is one of the important genes involved in ciliogenesis. In order to study the relationship of the Cep164 and CP110， explored the role of CP110 in the regulation of ciliogenesis by Cep164. Immunofluorescence staining and Western Blotting were used to determine the expression of CP110 gene in the Cep164 gene knockout cell and embryo of mice. The interaction between the Cep164 and CP110 protein was confirmed by COIP. The results showed the Cep164 gene mutation increased CP110 gene expression. Cep164 regulated the expression of CP110 in cells indirectly. CP110 degradation failure could be the one of reason for the Cep164 gene mutation cause cilia dysfunction.

Key words： Cep164 gene; CP110 gene; centriole

Cep164是中心體激活元件Cep家族一員，位于母中心粒基體末端，參與纖毛的形成過程[1]。Moumita等[2]發現Cep164基因在纖毛相關腎消耗病患者中發生純合子點突變。研究人員通過siRNA技術沉默細胞中Cep164基因證明了Cep164基因與纖毛形成過程中囊泡在母中心粒基體的定位有關，當Cep164基因突變時會導致細胞中纖毛缺失，但其參與纖毛形成的機制仍然不明確[3]。本研究在基因打靶法構建Cep164基因敲除鼠過程中發現Cep164基因完全缺失時小鼠將于E14.5 d前死亡[4]。E14.5 d前存活的Cep164-/-小鼠胚胎纖毛缺失，為確定Cep164基因缺失導致纖毛缺失的機制，對與纖毛形成附件蛋白進行間接免疫熒光染色評價，發現Cep164-/-小鼠胚胎細胞中纖毛形成appendage Ftm、Odf2、Cep290、Cep120、Ofd1和Ninein位置及表達量無明顯變化，但CP110在母中心粒和子中心粒均表達的比例增多。有關報道顯示CP110蛋白對中心粒的復制及纖毛的形成具有拮抗作用，CP110和Cep97可相互協調抑制纖毛軸絲的組裝[5]。CP110能導致過長的中心粒現象，并且發現基因敲除后通過細胞饑餓法無法促進纖毛形成[5-8]。本研究通過間接免疫熒光染色與Western印跡法確定Cep164基因缺失時CP110的表達情況，利用免疫共沉淀法確認Cep164與CP110是否存在直接調節作用，探討Cep164基因缺失導致小鼠胚胎纖毛缺失的機制。

1? 材料與方法

1.1? 試驗動物

Cep164基因敲除雜合子小鼠（Cep164+/-）饋贈于美國康奈爾大學。

1.2? 試驗試劑

鼠抗兔Cep164，CP110（sigma，USA），γ-tubulin，a-tubulin（sigma，USA），間接熒光染色二抗CyTm3-conjugated Affinipure Goat Anti-mouse Ig G（H+L），Alexa Fluor 488-conjugated Affinipure Goat Anti-rabbit Ig G（H+L）（Jackon immuno research Co. USA），6孔、96孔細胞培養板（Costar，USA），100 mm細胞培養皿（Costar，USA）等。PLNCX2-FS-Cep164與PRK-myc-CP110質粒（饋贈于美國康奈爾大學）。

1.3? 試驗方法

1.3.1? Cep164基因缺失胚胎的制備? Cep164基因敲除雜合子雌鼠（Cep164+/-）與Cep164+/-雄鼠進行雜交，交配后雌鼠陰道栓出現記作交配成功，計算孕期，雌鼠懷孕8.5 d，斷頸處死后，剝離胎鼠，通過基因型鑒定獲得WT與Cep164-/-胚胎。

1.3.2? 小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）的分離培養與間接免疫熒光染色? 根據原代細胞培養方法制備野生型（WT）與Cep164-/-胚胎MEFs，加入包備蓋玻片的6孔板中培養48 h，甲醇溶液固定5 min，PBS溶液洗滌后，加入一抗混合液（γ-tubulin，CP110）100 μL，4 ℃孵育過夜。PBST溶液洗滌3次后，加入二抗100 μL（cyTm3抗鼠抗體1∶250，Alexa Fluor 488抗兔抗體1∶250）避光室溫孵育1 h，DAPI染色液封片，觀察拍照。

1.3.3? 冰凍組織切片的制備與間接免疫熒光染色? WT與Cep164-/-胚胎于4%多聚甲醛中4 ℃固定1 h，30%蔗糖脫水，OCT包埋后制備切片（10 μm）。切片組織封閉液封閉后，加入一抗混合液4 ℃孵育過夜，加入二抗孵育1 h， DAPI染色液封片，觀察拍照。

1.3.4? 小鼠胚胎Cep164、CP110蛋白表達的測定? 取Cep164-/-和WT胚胎加入300 μL RAPI裂解液制成勻漿，4 ℃下16 000 r/min離心30 min。取60 μg加入5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，轉移至聚偏氟丙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入1∶1 000稀釋的一抗Cep164、CP110、a-tub，4 ℃孵育過夜。膜經PBST溶液漂洗后放于1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。增強化學發光法（ECL）顯色。暗盒沖洗膠片，掃描并用Quantity One軟件分析試驗結果。

1.3.5? 免疫共沉淀法檢測Cep164與CP110蛋白的關系? 分別取PLNCX2-FS-Cep164與PRK-myc-CP110質粒1 μg加入2.5 mol/L的CaCl2溶液，2×HBS溶液各100 μL混勻。將混合液室溫靜置30 min后，逐滴均勻加入293細胞（每孔細胞密度達25%～30%）中。在標準生長條件下培養細胞，轉染后8 h換培養液，72 h后每孔細胞加300 μL NP40裂解液4 ℃下16 000 r/min離心20 min，取上層液250 μL于40 μL Flag抗體-polyA-beads孵育2 h，洗滌后加入30 μL的1×loading Buffer溶液，37 ℃加熱5 min，離心后取上層液上樣，進行蛋白含量檢測，方法同上。

2? 結果與分析

2.1? Cep164基因敲除抑制CP110在細胞循環中的降解

如圖1A所示，在WT與Cep164-/-細胞中心粒上均觀察到CP110表達。計數統計細胞CP110表達比例，發現Cep164-/-細胞100%表達在兩個中心粒，而WT細胞僅為66%，有34%的細胞CP110僅表達在一個中心粒上（圖1B）。如圖1C所示，Cep164-/-胚胎中的CP110蛋白的表達量高于WT，與圖1A結果一致。由圖1D發現，Cep164-/-胚胎神經管周圍中心粒全部存在CP110表達，WT胚胎一些中心粒中無CP110表達（如箭頭所示），Cep164-/-胚胎神經管中CP110表達密度高于WT胚胎，結果與圖1B結果一致。Cep164基因影響了CP110在中心粒上的表達，這可能與Cep164基因的缺失阻礙了CP110在細胞循環上的降解有關，從而導致了CP110在Cep164-/-細胞中的高表達。

2.2? Cep164通過間接作用調控CP110在細胞循環中的降解

如圖2A所示，CP110的兩個表達點位于細胞核的中心粒上，每個表達點有兩個點組成，Cep164位于細胞核上側CP110表達點中的一個點上，說明Cep164在細胞中表達位置臨近或位于CP110上。為證明Cep164是否與CP110直接作用，通過免疫共沉淀法檢測發現，共轉染FLNCX2-FS-Cep164與PRK-myc-CP110質粒細胞均表達Cep164與CP110蛋白，但通過Flag-bead拉下的蛋白中并未檢測到CP110（圖2B），說明Cep164與CP110蛋白無直接相互作用。

3? 討論

在前期基因打靶法構建Cep164基因敲除鼠過程中發現當Cep164基因完全缺失時纖毛缺失，與其他研究人員通過siRNA技術沉默細胞中Cep164基因的纖毛缺失表型一致[1]。研究通過細胞、組織間接免疫熒光染色與蛋白檢測均證實Cep164基因缺失導致CP110在中心粒上的表達上調。CP110蛋白表達在中心體的兩個中心粒上，是控制中心粒長度與纖毛形成的重要基體附件蛋白之一[9-11]，對纖毛的形成起到抑制作用，當細胞進入G0期間，母中心粒上CP110蛋白通過TTBK2介導降解，解除對纖毛形成的抑制[12]。本研究結果表明，CP110在Cep164基因缺失組中表達上調，而纖毛表達缺失，可能是Cep164基因敲除阻礙了CP110蛋白的降解過程，表現為Cep164-/-細胞中母細胞表達CP110比例增加。本研究對胚胎中CP110蛋白表達水平檢測，Cep164/-胚胎中CP110蛋白表達高于WT胚胎，進一步說明Cep164基因突變抑制了CP110蛋白降解。在間接熒光染色圖片上觀察到CP110與Cep164在表達位置上有重疊，但由于間接熒光染色的局限性，不能確定Cep164直接或間接參與CP110蛋白的降解。本研究通過免疫共沉淀檢測Cep164與CP110蛋白相互作用關系，結果發現Cep164與CP110蛋白無直接相互作用，說明Cep164基因通過間接方式參與CP110降解。Oda等[13]報道與TTBK2需與Cep164結合定位中心粒，參與纖毛形成過程。Cep164基因敲除導致CP110蛋白的降解失敗，可能是由于G0期間，Cep164基因參與TTBK2蛋白募集到母中心粒上，Cep164基因敲除導致TTBK2蛋白募集失敗，導致CP110在母中心粒上無法降解。