單囊胚凍融移植周期中囊胚質量對妊娠結局和新生兒結局的影響

郭 娜 遠孝瓊 堯陽城 鄧陶然 杜瑤瑤 騰雪梅 李豫峰

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院生殖中心，湖北省武漢市 430000，電子郵箱：tsguona@126.com)

近年來，隨著社會壓力增大、環境污染加劇、婦女生育年齡推遲以及二胎政策放開，不孕癥患病率逐年上升[1-2]。高齡、卵巢功能減退的不孕患者越來越多[3]，其臨床表現為卵巢刺激反應不佳，獲卵數少，卵母細胞質量差，可供移植胚胎數量及質量下降[3-4]。大多數女性會對移植非優質胚胎的母嬰結局感到焦慮，臨床醫生也可能會對移植非優質胚胎猶豫不決。人類輔助生殖技術的理想結局是單胎健康活產。胚胎質量是決定體外受精-胚胎移植成功率的主要預測指標。目前，很少有研究關注胚胎質量與妊娠結局、新生兒結局的相關性。本研究通過回顧性分析2 593個單囊胚凍融移植周期的臨床資料，以評估胚胎質量對妊娠結局及新生兒結局的影響，為改進胚胎選擇策略及提高單囊胚凍融周期移植成功率提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2012年1月至2016年12月在我院接受單囊胚凍融移植的2 593個周期的臨床資料。納入標準：(1)夫妻雙方染色體核型正常；(2)單囊胚移植周期；(3)女方宮腔形態正常，無子宮畸形、宮腔粘連、子宮多發性內膜息肉、子宮內膜炎、子宮內膜結核，無不良孕產史及反復流產病史。排除標準：夫妻雙方任一方存在甲狀腺疾病、糖尿病、高血壓等代謝性疾病史。本研究進行單囊胚移植周期的原因如下：(1)新鮮周期移植后僅剩1個符合冷凍標準的囊胚用于冷凍保存；(2)囊胚由于冷凍損傷，復蘇后僅剩1個存活囊胚可供移植；(3)瘢痕子宮或避免多胎妊娠，復蘇周期患者僅要求移植1個存活囊胚。采用Gardner囊胚評分體系[5]評估囊胚質量，根據囊胚質量不同分為優質囊胚組1 727個和非優質囊胚組866個。兩組的女方年齡、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、體質指數、子宮內膜厚度、不孕年限及類型、不孕病因及內膜方案比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表1。本研究通過本院醫學倫理委員會批準，所有患者夫妻雙方均了解并知情同意。

表1 兩組間基礎資料的比較

1.2 囊胚培養及評估 采用常規體外受精、卵胞漿內單精子顯微注射技術 (intracytoplasmic sperm injection,ICSI)進行受精，16～18 h后進行觀察，根據胚胎卵裂情況，于體外受精后第3天挑選1～2個卵裂期胚胎用于新鮮周期移植或冷凍，剩下的胚胎轉移至G2囊胚培養液中繼續培養2～3 d，將達到冷凍標準的囊胚進行玻璃化冷凍保存。于體外培養第5、6天對囊胚形態進行評估，按照Gardner囊胚評分體系[5]根據囊腔擴張程度對囊胚進行分期：囊腔范圍小于胚胎體積的一半為1期；囊腔范圍超過胚胎體積的一半為2期；囊腔占滿整個胚胎為3期；囊腔完全擴張，透明帶變薄為4期； 囊胚開始孵化為5期；囊胚完全孵出為6期。3期及以上的囊胚，則進一步對囊胚內細胞團(inner cell mass，ICM)和滋養外胚層(trophectoderm，TE)進行評級。ICM評級標準[5]：A級為ICM細胞數多，緊密成團，清晰可見；B級為ICM細胞數少，排列松散；C級為ICM細胞數極少，幾乎沒有，不清晰。TE評級標準[5]：A級為TE細胞數多，呈鐮刀形連續平鋪；B級為TE細胞數少，排列松散；C級為TE細胞數極少，幾乎沒有，不清晰。冷凍標準：于囊胚培養第5、6天觀察囊胚形態，若囊胚在3期及以上，且ICM或TE評級在B級以上，其中3BB及以上的囊胚為優質囊胚，而AC/BC/CA/CB囊胚為非優質囊胚。

1.3 囊胚冷凍及復蘇程序 本研究所用冷凍液、載桿、復蘇液均購自日本KITAZATO生物制藥有限公司。按照本中心常規步驟進行囊胚冷凍復蘇[6]。復蘇后的囊胚均置入37℃的COOK桌面培養箱培養，2 h后觀察囊胚色澤及囊胚腔是否重新擴張，囊腔部分或全部擴張為存活，進行移植。

1.4 內膜準備方法 (1)自然周期：于患者月經周期第10～12天采用B超監測卵泡及內膜，排卵當日查血黃體生成素、雌二醇、孕激素水平，于排卵后4～5 d進行凍融囊胚移植。(2)人工周期：按遞增法口服戊酸雌二醇(補佳樂，德國拜耳制藥)，服用方法為月經第2～4天2 mg/d(1次/d),第5～8天2 mg/d(2次/d),第9～12天3 mg/d(2次/d),根據內膜厚度調整用藥量及時間。當內膜厚度達到7 mm及以上且雌激素作用時間不少于10 d時，給予黃體酮轉化內膜，在轉化的第6天進行囊胚解凍。

1.5 移植后的支持治療 黃體支持方案有兩種：(1)黃體酮陰道緩釋凝膠(默克雪蘭諾公司，規格：90 mg/支)，90 mg/次，1次/d，置于陰道；并口服地屈孕酮(蘇威制藥廠，規格：10 mg/片)，10 mg/次，2次/d。移植后繼續給藥至12 d驗血。(2)黃體酮軟膠囊(法國法杏大藥廠，規格：100 mg/粒)，200 mg/次，1次/d，置于陰道；并口服地屈孕酮，20 mg/次，2次/d。移植后繼續給藥至12 d驗血。

1.6 妊娠及新生兒結局的評估 (1)著床：囊胚移植4～6周行陰道B超可見到孕囊數目。著床率=孕囊數/移植胚胎數×100%。(2)臨床妊娠：囊胚移植后12 d查血β人絨毛膜促性腺激素陽性，且移植后4～6周行陰道B超可見孕囊，包括宮外孕。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/總移植周期數×100%。(3)早期流產：妊娠后于12周前終止為早期流產。早期流產率=早期流產周期數/總移植周期數×100%。(4)異位妊娠：囊胚在子宮腔以外著床。異位妊娠率=異位妊娠周期數/總移植周期數×100%。(5)活產：胎兒娩出后至少具有以下一項生命體征，包括心跳、呼吸、臍帶搏動、隨意肌收縮。活產率=活產周期數/總移植周期數×100%。(6)多胎妊娠：移植后早孕期B超見到2個及以上的孕囊。多胎妊娠率=多胎妊娠周期數/總移植周期數×100%。(7)引產：因發現胎兒畸形、母親嚴重妊娠并發癥而不能繼續妊娠或其他原因(不包括死胎)人為終止妊娠。引產率=引產周期數/總移植周期數×100%。(8)母體并發癥：主要包括妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病、胎膜早破、前置胎盤等。(9)低出生體重兒：出生體重小于2 500 g。(8)極低出生體重兒：出生體重小于1 500 g。(10)巨大兒：出生體重大于4 000 g。(11)早產：活產周期中，滿20周至37周前分娩。(12)出生缺陷：在出生時或出生以后表現的結構、功能或發育異常，可能是由出生前遺傳或非遺傳因素造成。(13)圍生期死亡兒：死產及胎兒娩出后早期新生兒死亡。

1.7 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以(x±s)表示，比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以[M(P25，P75)]計數資料以例數和百分比表示，比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組的妊娠結局比較 優質囊胚組有1 288個(74.58%)常規體外受精周期和439個(25.42%)ICSI周期，非優質囊胚組有604個(69.75%)常規體外受精周期和262個(30.25%)ICSI周期，優質囊胚組常規體外受精比例高于非優質囊胚組，ICSI比例低于非優質囊胚組(χ2=6.833，P=0.009)。優質囊胚組著床率、臨床妊娠率、活產率均高于非優質囊胚組(均P<0.05)，而兩組間異位妊娠率、早期流產率、多胎妊娠率、引產率及母體并發癥發生率比較，差異無統計學意義(均P>0.05)，見表2。優質囊胚組共9個周期引產，其中4例因胎兒畸形(腎臟畸形1例、脊柱畸形1例、心臟畸形1例、唇腭裂1例)引產，2例因染色體異常引產，另外3例因孕中期胎死宮內而引產；非優質囊胚組共4個周期引產， 其中2例因胎兒畸形(唇腭裂1例，腦部結構發育異常1例)引產，1例胎膜早破而引產，1例重度子癇而引產。

表2 兩組間妊娠結局的比較[n(%)]

注：優質囊胚組的27個多胎妊娠周期中，中途流產15個，最終只有12個雙胎活產周期；非優質囊胚組的6個多胎妊娠周期均在中途流產。

2.2 兩組新生兒一般情況及結局比較 優質囊胚組有12個雙胎妊娠活產周期(其中8個為男性雙胎，4個為女性雙胎)，非優質囊胚組無雙胎活產周期。本研究僅比較兩組間單胎妊娠的新生兒結局。優質囊胚組男性新生兒比例高于非優質囊胚組(P<0.05)，兩組間新生兒分娩方式、出生時孕周、出生體重以及早產兒比例、低出生體重兒比例、極低出生體重兒比例、巨大兒比例、圍生期死亡兒比例、出生缺陷發生率比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表3。優質囊胚組單胎妊娠新生兒有3例出生缺陷，包括心臟發育不良1例、女嬰卵巢囊腫1例、軟腭裂1例；非優質囊胚組單胎妊娠新生兒有2例出生缺陷，包括Turner綜合征1例、左心室未閉合1例。

表3 兩組單胎妊娠新生兒一般情況及結局的比較

3 討 論

目前，在世界范圍內每6對夫妻中就有一對受到不孕癥的影響，這影響了家庭穩定及社會和諧。自1978年世界上第1例試管嬰兒誕生以來，人類輔助生殖技術獲得了突飛猛進的發展，給許多不孕癥患者家庭帶來了福音。但是，伴隨著床率提高的同時，醫源性多胎妊娠已經成為人類輔助生殖技術最常見的并發癥之一。單胚胎移植被認為是減少多胎妊娠的最佳方法，而胚胎質量則是影響單胚胎移植成功率的主要因素。有學者認為胚胎質量與著床率、臨床妊娠率相關[7]，而其與產科結局和新生兒結局的關系卻尚不清楚。移植不同質量的胚胎對母嬰結局的影響，成為生殖專家及不孕癥患者們共同關注的問題。

成功的人類輔助生殖技術妊娠依賴于良好的子宮內膜容受性，同時選擇優質胚胎進行移植也是影響其結果的重要因素。有研究表明，移植質量較差的胚胎可能會降低臨床妊娠率和活產率[8]，這可能是因為質量較差的胚胎具有較高的非整倍體率[9]。本研究通過設置嚴格的納入、排除標準，排除了移植胚胎個數和子宮內膜容受性等因素，采用凍融周期單囊胚移植模型來研究胚胎質量對母體和子代的影響，結果顯示優質囊胚組的臨床妊娠率及活產率高于非優質囊胚組(P<0.05)。這可能與受精方式的不同影響了妊娠結局有關：與非優質囊胚組比較，優質囊胚組常規體外受精的比例更高，而ICSI的比例更低(P<0.05)。既往研究表明，ICSI雖然可以改善獲卵數少的患者的受精率，但并不能提高胚胎利用率、優質胚胎率[10]。與常規體外受精過程相比，ICSI將單個精子直接注射到卵母細胞內，可能增加了對卵母細胞結構的損傷，同時繞過了卵母細胞對精子自然選擇的屏障，使質量差的精子受精，從而影響了胚胎質量和妊娠結局。有學者認為，選擇形態學評分較差的胚胎進行移植，一旦達到臨床妊娠，大多數都可獲得活產，這對于反復出現胚胎發育較差的女性而言是不錯的選擇[11]。而在本研究中，移植質量較差的囊胚也能獲得33.6%的活產率。

目前，有關胚胎質量對新生兒結局影響的研究報道較少。有學者認為，胚胎質量對母體及子代健康的影響不應忽略不孕因素本身會增加圍生期風險，比如早產、低出生體重兒、子癇前期、胎膜早破等，其中卵巢早衰可能會增加母體并發癥發生率[7]。而本研究中，不同質量胚胎組在母體并發癥發生率、分娩方式、孕周、出生體重、早產兒比例、低出生體重兒比例、極低出生體重兒比例、巨大兒比例、出生缺陷發生率等方面差異并無統計學意義(P>0.05)。Oron等[7]在研究1541例新鮮單胚胎移植周期臨床結局時發現，移植質量較差的胚胎并未增加圍生期和新生兒不良結局的發生率。Nakagawa等[11]在評估移植胚胎質量與最終圍產結局關系時發現，移植質量較差的胚胎達到臨床妊娠的可能性雖然低于移植優質胚胎，但一旦達到臨床妊娠，其獲得活產的概率以及圍生期結局與移植優質胚胎者相似，這一研究結果為只能選擇劣質胚胎進行移植的患者提供了良好的心理安慰和有力的數據支撐。本研究結果與上述研究結果類似，然而局限于本研究的實驗設計和樣本量，所得結論需要樣本量更大的前瞻性研究加以驗證。此外本研究中，優質囊胚組男性新生兒比例高于非優質囊胚組(P<0.05)，這可能與非優質囊胚組ICSI比例更高有關，行ICSI治療的夫婦多為男性不育，其含Y染色體精子的受精能力下降，或含X染色體的精子比含Y染色體的精子更容易優先獲得[12]。Huang等[13]利用Timelapse延時攝像系統觀察胚胎發育動力學參數與活產胎兒性別之間關系，發現男胚比女胚生長速度快，當胚胎冷凍復蘇時，優質男胚更容易被選中移植。

綜上所述，單囊胚凍融移植周期中，囊胚質量雖然會影響母體妊娠率和活產率，但移植質量較差的囊胚并不會增加圍生期不良結局和新生兒缺陷的發生率。選擇質量差的胚胎進行移植對于反復出現胚胎發育較差的女性而言會是不錯的選擇。