響應面法優化矮地茶中3種有效成分提取工藝

肖鵬飛，王良貴，張 新，艾雨欣，代 青

（麗水學院生態學院，浙江麗水323000）

矮地茶為紫金牛科紫金牛屬植物紫金牛Ardisia japonica的干燥全株，常用于新久咳嗽、喘滿痰多、濕熱黃疽、經閉瘀阻、風濕痹痛和跌打損傷的治療[1]。矮地茶中主要有效成分巖白菜素、槲皮素與山奈酚等與其臨床藥理密切相關[2]。因此，探究矮地茶中主要有效成分的提取工藝可為其質量控制與綜合利用提供實驗基礎。響應面優化法以其好預測性、實驗簡單、高效等特點在中藥提取、中藥制劑工藝、中藥處方篩選等方面得到很好應用[3－4]。黃懿等報道了應用響應面優化矮地茶中多糖提取工藝[5]，但以矮地茶中巖白菜素、槲皮素與山奈酚為提取對象的工藝優化還未見報道。因此，本文以矮地茶中巖白菜素、槲皮素與山奈酚提取率的綜合評分為指標，基于單因素試驗結果，以星點設計-響應面法優化矮地茶中有效成分提取工藝，為矮地茶綜合利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生的新鮮矮地茶全株于2016年11月從浙江麗水蓮都區藥農處購得，經主任中藥師鑒定為紫金牛科植物紫金牛，然后以去離子水清凈、60℃真空烘干、粉碎、過80目篩后備用。

Agilent 1100型高效液相色譜儀（20 μL定量進樣環、Extend-C185μm、4.6 mm×250 mm色譜柱（美國安捷倫公司））；KQ-250DE型數控超聲波清洗器（總功率250 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；槲皮素對照品（批號：100081-200907）、巖白菜素對照品（批號：111532-201203）購于中國食品藥品檢定研究院；山奈酚對照品（百靈威科技有限公司，純度98%），甲醇、乙腈（色譜純，美國（TEDIA）天地試劑公司），水為高純水，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

預實驗及參考相關文獻[6-8]確定測定槲皮素色譜條件為流動相乙腈-0.4%冰醋酸水溶液（60:40，V/V），檢測波長372 nm；巖白菜素測定條件為流動相甲醇-水（35:65，V/V），檢測波長274 nm；山奈酚測定條件為流動相乙腈-0.5%冰醋酸水溶液（40:60，V/V），檢測波長359 nm，進樣量20 μL，流動相流速1.0 mL·min-1，柱溫為室溫。

1.2.2 對照品溶液的制備

以甲醇為溶劑配制濃度分別為 23.00、11.50、2.300、1.150、0.5750、0.2875 mg·L-1槲皮素對照品溶液，12.00、4.800、2.400、1.200、0.6000 mg·L-1山奈酚對照品溶液；以甲醇 - 水（2：1，V/V） 為溶劑配制 10.42、4.170、2.083、1.042、0.5210 mg·L-1巖白菜素對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液制備

精密稱取矮地茶粉末1.0 g，置于具塞碘量瓶中，加入20 mL所選提取劑，置于37℃水浴浸泡0.5 h，以所選功率超聲處理45 min，G5砂芯漏斗過濾，濾渣重復提取1次，過濾，合并濾液，以提取劑定容到50 mL，從中準確移取25 mL到100 mL圓底燒瓶中，加5%鹽酸10 mL及甲醇5 mL，回流至無沉淀產生，旋蒸近干，氮氣吹干，殘渣用甲醇溶解并轉移至10 mL量瓶中，混勻，過0.45 μm有機濾膜即為供試品溶液。

1.3 分析方法精密度和穩定性試驗

對1.2.3項供試液按1.2.1項色譜條件連續分析5次，依色譜圖中槲皮素、山奈酚和巖白菜素的相應色譜峰面積計算三者峰面積的相對標準偏差值RSDs。分別在0、2、4、6、8、12 h按1.2.1項條件分析同一供試液，記錄槲皮素、山奈酚和巖白菜素色譜峰面積，計算三者峰面積的RSDs。

1.4 回收率試驗

分別準確稱取6份已知含量矮地茶粉末0.5 g于具塞錐形瓶中，精密加入相當質量的槲皮素、山奈酚和巖白菜素對照品，按1.2.3項制備供試液和1.2.1項分析，計算槲皮素、山奈酚和巖白菜素平均回收率以及相應RSDs。

1.5 單因素試驗

分別以提取時間（min）、提取溫度（℃）、液料比（mL·g-1）、超聲功率（W）和提取劑乙醇濃度（%，體積分數）為考察因素，觀察變化其中一個因素對槲皮素、巖白菜素和山奈酚提取率的影響。參照方法1.2.3制備供試品溶液，按1.2.1項進行分析。提取率（P%）表達式為：

1.6 CCD-RSM優化提取工藝

基于CCD-RSM試驗精度高、數學模型預測性好的特性[9-10]，在單因素試驗基礎上應用Design-Expert10.0.3.1軟件中CCD-RSM設計了5因素［提取時間X1（min）、提取溫度X2（℃）、液料比X3（mL·g-1）、超聲功率X4（W）和乙醇濃度X5（%，體積分數）］5水平表（見表1）。以槲皮素提取率（PQ）、巖白菜素提取率（PB）和山奈酚提取率（PK）為基礎計算綜合因子C[11]：

式中，10，60，30 為相應有效成分加權系數，CQ、CB、CK分別代表 C槲皮素、C巖白菜素和 C山奈酚，其中 Ci＝Pi/Pimax。

表1 因素水平

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

按1.2.1項色譜條件依次分析1.2.2項下對照品溶液，外標法定量，以峰面積A對質量濃度ρ（mg·L-1）進行線性回歸，得到回歸方程：A槲皮素=-113+881.3 ρ槲皮素（r=0.999 6，線性范圍 0.287 5 ～ 23.0 mg·L-1，檢出限 0.005 2 μg），A山奈酚=-1.85+70 077.62 ρ山奈酚（r=0.999 5，線性范圍 0.60 ～ 24.0 mg·L-1，檢出限 0.011 μg），A巖白菜素=0.94+25 863.71 ρ巖白菜素（r=0.999 8，線性范圍 0.521 ～ 20.83 mg·L-1，檢出限 0.002 8μg），色譜圖如圖1。由圖1中3種有效成分保留時間的差異可見，在所建立的色譜分析下3種有效成分得到良好分離。

2.2 分析方法精密度和穩定性試驗

按1.3項分析方法得到槲皮素、山奈酚和巖白菜素的色譜峰面積RSDs分別為2.11%、1.14%與1.87%，表明儀器精密度良好，三者理論板數均高于1 700。在0、2、4、6、8、12 h時按1.2.1項條件分別分析同一供試液得到槲皮素、山奈酚和巖白菜素峰面積的RSDs分別為2.71%、1.18%和1.64%，說明供試品溶液在12 h內穩定。

圖1 矮地茶3種有效成分HPLC圖

2.3 回收率試驗

按1.4項獲得槲皮素、山奈酚和巖白菜素平均回收率分別為97.08%、107.2%、98.11%，峰面積RSDs分別為2.58%、1.47%和1.53%。

2.4 單因素試驗

單因素試驗結果見圖2。圖2顯示有效成分的提取率隨液料比、乙醇濃度、超聲功率、提取溫度、提取時間的增大先上升，然后分別在液料比30 mL·g-1、乙醇濃度75%、超聲功率225 W、40℃下提取60 min基本達到最大值。圖2中（a）、（c）、（e）圖顯示巖白菜素提取率隨提取時間、液料比和乙醇濃度增大而快速上升，說明上述3個因素對巖白菜素提取率的影響大于其他2種有效成分。從單因素試驗結果難于比較所考察的5個因素各自對PQ、PB和PK的貢獻大小，因素間交互作用對考察目標的貢獻不明確。

圖2 單因素試驗

2.5 CCD-RSM優化

以表1各因素水平按表2試驗編號進行實驗，PQ、PB、PK和C結果見表2。對表2中C進行多元線性回歸擬合，結果顯示二階交互模型擬合好，以各因素實際數值擬合的回歸方程為：

C=179.9+6.438X1-8.553X2+2.282X3-1.441X4-1.104X5-0.0248X1X2-0.0709X1X3-0.0381X1X4-0.0111X1X5+0.0314X2X3+0.0888X2X4+0.0312X2X5-0.0218X3X4+0.0178X3X5-5.34×10-3X4X5。

回歸方程一次項各項系數絕對值的大小反映了各因素對綜合因子C的影響程度，系數的正負反映了影響的方向。由方程可知，對C的影響程度依次為X2＞X1＞X3＞X4＞X5，交互作用影響C的順序為X2X4＞X1X3＞ X1X4＞ X2X3＞ X2X5＞ X1X2＞ X3X4＞ X3X5＞ X1X5＞X4X5。從方程一次項系數可知，提取時間、液料比對槲皮素提取率、山奈酚提取率呈正相關性，提取溫度、超聲功率和乙醇濃度則呈負相關性，這與單因素試驗結果不同，說明了上述回歸方程是各因素綜合所得。對該模型進行方差分析及模型系數顯著性檢驗的結果見表3。回歸方程中各變量對響應值C影響的顯著性用F檢驗來判定，概率P值越小，則相應變量的顯著程度越高，即P＜0.01時影響為高度顯著，P＜0.05時影響顯著。由表3可知，模型P值均＜0.000 1、失擬項P＞0.05和模型的校正決定系數R2Adj為0.861 5，說明二階交互模型有極高的顯著性，模型擬合度良好；X5、X4、X3、X2和 X2X4、X1X3、X1X4、X2X5、X1X2的 P 值均＜0.05，表明它們對 C 有顯著影響。所以，為更清晰表達單個因素和兩因素交互作用對試驗影響，刪除擬合回歸方程中的非顯著項后得到的回歸方程為：

C=179.9-8.553X2+2.282X3-1.441X4-1.104X5-0.0248X1X2-0.070 9X1X3-0.038 1X1X4+0.088 8X2X4+0.031 2X2X5。

對C有顯著影響的兩因素交互作用三維曲面圖見圖3。

表2 CCD-RSM試驗及其結果

表2 續表

表2 續表

表3 回歸統計方差分析結果

圖3 顯著交互項對C響應面圖

優選的提取工藝為1.0 g矮地茶粉末加65%乙醇20 mL，在32℃水浴、超聲功率162 W下提取48 min，預測槲皮素提取率0.003 71%、巖白菜素提取率0.736%、山奈酚提取率0.068 2%，綜合因子C為83.32。

2.6 驗證試驗

稱取1.000 g矮地茶粉末加65%乙醇20 mL，在30℃水浴、超聲功率150 W下提取50 min，平行5份，得到槲皮素、巖白菜素和山奈酚平均提取率分別為0.003 35%、0.741%、0.070 2%；RSD分別為3.1%、2.6%、2.8%，綜合因子83.75，驗證值和預測值誤差在±0.3%范圍內，無顯著性差異，擬合方程可較好地描述評價指標與因素間關系，具有實際價值。

3 結論與討論

試驗結果顯示，應用CCD-RSM優選的矮地茶中槲皮素、巖白菜素和山奈酚3種有效成分提取參數具有實際操作性，平行性驗證試驗說明實驗結果與模型預測值無顯著性差異，優化建立的數學模型可指導試驗實踐，為矮地茶中有效成分的綜合利用提供技術支持。

矮地茶是許多中藥復方制劑中的一味中藥，因此探討矮地茶有效成分的提取工藝有實際意義。由于超聲波輔助提取法具有提取效率高、快速、提取成分完全，故本實驗采用超聲輔助提取。槲皮素、巖白菜素和山奈酚的HPLC分析所用檢測波長是對相應的適宜濃度標準品溶液進行190～700 nm全波長掃描后確定的。在制備供試品溶液時，若在測定指標成分含量時直接用提取液進樣，由于溶劑效應導致峰變寬、分離效果差。故將提取液旋蒸、N2吹干后用甲醇溶解，既能保證浸膏可全部溶解，又能避免溶劑效應。在以星點設計-響應面法優化矮地茶提取工藝中，本實驗采用綜合因子評價法，因為結合多個指標的綜合因子評價法更貼近中藥材的使用實際，避免了單一指標的優選設計的局限性和不確定性。每味藥材含有多種化學組份，并且中醫理論研究表明，中藥材的功效是與其性味密切相關的，而藥材的性味是其中多個化學組份綜合表現出來的，因此，運用綜合因子評價法的提取工藝制備的制劑更符合實際。綜合因子C公式中槲皮素提取率（PQ）、巖白菜素提取率（PB）和山奈酚提取率（PK）的權重系數是依據各組份在矮地茶中含量并結合參考文獻［12-14］確定的，更具體詳實權重系數有待進一步研究。驗證實驗獲得的槲皮素、巖白菜素和山奈酚平均提取率和單因素實驗結果有所差異，這是由于驗證實驗是在多因素二次回歸優化所得工藝條件下進行的，是綜合性的結果，而單因素試驗是線性的單一因素變化的實驗結果。