酸性染料在四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜中的離子化與裂解規律

李 雙，王春芳，方科益，陳樹兵*,曹國洲,韓 超，王傳現

(1.寧波海關 技術中心，浙江 寧波 315040；2.寧波中盛產品檢測有限公司，浙江 寧波 315040;3.浙江樹人 大學 生物與環境工程學院,浙江 杭州 310015;4.上海海關 動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135)

隨著質譜的發展和推廣，工業染料檢測正逐漸向利用高分辨質譜(HRMS)進行精確質量非目標型全掃描檢測轉變[16-19]。四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(Q-Orbitrap-HRMS)可對目標化合物的準分子離子峰進行不同能量段的二級全掃描分析，在分辨率高達70 000情況下，可直接采集碎裂片段的高準確度質量數(分辨率>70 000,m/z200，誤差值<5×10-6)。Q Exactive 質譜儀的Xcalibur軟件還配備了全自動元素模擬功能，通過輸入各目標化合物的元素組成及各元素的數量范圍，進而模擬出超高分辨率下各個碎裂片段的元素組成，有助于快速推測出該類化合物的裂解途徑，并總結出各類化合物的特征離子碎片，為目標化合物的快速鑒定提供依據。

本文通過四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜，對18種酸性染料的分子離子峰存在形式進行探究，并在分辨率高達70 000條件下，直接采集準分子離子峰碎裂片段的高準確度質量數(分辨率>70 000，m/z200)，對代表性化合物(酸性紅1、酸性藍9和酸性紅18)的質譜裂解規律進行研究，為此類化合物的快速鑒定提供了依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Q-Exactive 四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀(ThermoFisher Scientific公司)，配有H-ESI Ⅱ源；注射泵直接進樣；Milli-Q 高純水發生器(美國Millipore 公司)。

18種酸性染料標準品購自Sigma和Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥95%；乙腈(色譜純，德國Merck公司)，甲酸銨(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)，實驗用水為Milli-Q超純水(18.2 MΩ·cm)。

標準溶液的配制:分別稱取各酸性染料標準品適量，用水溶解，以乙腈-水(體積比1∶1,5 mmol/L甲酸銨)稀釋成10 mg/L的標準溶液，于4 ℃避光保存。

1.2 質譜條件

正/負離子轉換模式，質量范圍:m/z50～800，分辨率70 000(m/z200)，自動增益控制(AGC)目標值為5e5；離子源電壓:2 700 V(ESI-)和3 500 V(ESI+)；離子傳輸管溫度為300 ℃，鞘氣流速(N2)為5 L/h，輔助氣流速(N2)為5 L/h，氣化室溫度為80 ℃；在樣品運行前對儀器分別進行正/負離子校正；二級質譜分辨率為35 000，自動增益控制(AGC)目標值為2e5，碰撞能量范圍為10 ～100 eV。注射泵直接進樣，流速為10 μL/min。

2 結果與討論

2.1 分子離子峰的形成

表1 18種酸性染料的最佳電離方式、分子離子峰存在形式、基峰m/z值和碎裂片段Table 1 The best ionization mode,molecular ion peak,the base peak m/z value and fragmentation fragment of 18 acid dyes

2.2 二級質譜裂解規律解析

選取代表性酸性染料(酸性紅1、酸性藍9和酸性紅18)，通過四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜對其準分子離子峰進行二級全掃描分析，獲得信息豐富、質量數精度高的碎裂片段(分辨率為35 000，m/z200)，再通過輸入各目標化合物的元素組成及各元素的數量范圍，進而模擬超高分辨率下各碎裂片段的元素組成(表1)(誤差值<5×10-6)，快速推測出該類化合物的裂解途徑，并總結各類化合物的特征離子碎片，為目標化合物的快速鑒定提供依據。

2.2.1 酸性紅1的MS/MS質譜分析酸性紅1的分子離子峰包括:單電荷的m/z464.023 8 [*M+H]-和m/z486.006 0 [*M+Na]-，以及帶雙電荷的m/z231.507 8 [*M]2-。其中以雙電荷的m/z231.507 8 [*M]2-作為準分子離子峰(*M為脫去2個鈉離子后的帶電離子，圖1A)，其是由磺酸根失去2個鈉離子后生成帶2個負電荷的磺酸根離子態所形成，分別對雙電荷的m/z231.507 8 [*M]2-和單電荷的m/z464.023 8 [*M+H]-進行不同能量的二級質譜掃描(CE:10～100 eV)，并對整個能量范圍內的二級質譜圖進行疊加(圖1B、C)，二級碎裂片段的斷裂位點如圖1D所示。由圖1B可知，雙電荷的m/z231.507 8 [*M]2-產生的主要碎裂片段離子有4個，借助元素模擬得出碎裂片段離子的元素組成，進而推測出該化合物的裂解過程如下:m/z178.984 5 [C12H8O2N(SO3)2]2-是偶氮基團在近萘環端C—N發生裂解，在萘環端形成的雙電荷碎裂片段；m/z171.472 7 [C11H5O2N(SO3)2]2-是在m/z178.984 5的基礎上，與萘環相連的支鏈末端—CH3同步丟失形成的碎裂片段；m/z157.979 0 [C10H6ON(SO3)2]2-是在m/z178.984 5的基礎上，萘環端支鏈—C—NH—進一步發生裂解后形成；m/z79.955 7 [SO3]-是含磺酸基化合物的典型碎片離子，可作為該類化合物的特征離子碎片。

由圖1C可知，單電荷的464.023 8 [*M+H]-產生的主要碎裂片段離子有4個:其中m/z358.978 3 [C12H9O2N(SO3)2]-，m/z343.954 8 [C11H6O2N(SO3)2]-，m/z316.967 5 [C11H6O2N(SO3)2]-和m/z79.955 7 [SO3]-與圖1B中產生的碎裂片段一一對應；新產生的碎裂片段離子有:m/z263.997 8 [C11H6O2N(SO3)]-，是一端偶氮基團在近萘環端C—N發生斷裂，另一端萘環相連的支鏈末端—CH3同步丟失形成m/z343.954 8 [C11H6O2N(SO3)2]-的基礎上，結合H原子的磺酸基最終斷裂后形成。同時，m/z79.955 7 [SO3]-碎裂片段的存在也證實了上述推測，并通過對采集的碎裂片段高精度質量數進行元素模擬證實了上述結論(誤差值<5×10-6)。

2.2.2 酸性藍9的MS/MS質譜分析酸性藍9的結構中有3個磺酸根離子，形成的分子離子峰包括:單電荷的m/z747.152 0 [*M+H]-，雙電荷的m/z373.071 7 [*M]2-，三電荷的m/z249.050 4 [*M-H]3-。其中以雙電荷的m/z373.071 7 [*M]2-作為準分子離子峰(*M為脫去2個鈉離子后的帶電離子，圖2A)，其是由磺酸根失去2個鈉離子后生成帶2個負電荷的磺酸根離子態所形成。由于三電荷的m/z249.050 4 [*M-H]3-產生的碎裂片段數值小，誤差干擾大，不進行二級質譜分析。分別對雙電荷的m/z373.071 7 [*M]2-和單電荷的m/z747.152 0 [*M+H]-進行不同能量值的二級質譜掃描(CE:10～100 eV)，并對整個能量范圍內的二級質譜圖進行疊加(圖2B、C)，二級碎裂片段的斷裂位點如圖2D所示。由圖2B可知，雙電荷的m/z373.071 7 [*M]2-產生的主要碎裂片段離子有5個，借助元素模擬得出碎裂片段離子的元素組成，進而推測出該化合物的裂解過程如下:m/z333.093 2 [C37H34N2(SO3)2]2-是2個磺酸根失去鈉離子后生成帶2個負電荷的磺酸根離子態，同時，結合H原子的磺酸基斷裂后形成的雙電荷碎裂片段；中間苯環與靠近中間苯環的C—C鍵發生斷裂，含單個磺酸根離子部分形成單電荷碎裂片段m/z295.124 3 [C15H21N(SO3)]-；m/z288.069 8 [C30H28N2(SO3)2]2-和m/z170.003 1[C7H6(SO3)]-是與含磺酸根離子外側苯環相連的C—N鍵斷裂，其中，含單個磺酸根離子部分形成單電荷碎裂片段m/z170.003 1，含雙磺酸根離子部分形成雙電荷碎裂片段m/z288.069 8；同樣地，該類化合物很容易形成m/z79.955 7 [SO3]-典型碎片離子。由圖2C可知，單電荷的m/z747.152 0 [*M+H]-產生的主要碎裂片段離子有6個:其中包括m/z667.194 1 [C37H35N2(SO3)2]-，m/z577.146 2 [C30H29N2(SO3)2]-，m/z170.003 1 [C7H6(SO3)]-，與圖2B中產生的碎裂片段一一對應，只是某個磺酸根離子與溶劑中的H原子結合，形成的碎裂片段呈現單電荷狀態；新產生的碎裂片段離子有3個:m/z587.236 5 [C37H35N2(SO3)]-，是由于其中2個磺酸根離子發生斷裂，剩余部分形成了含單個磺酸根離子的單電荷碎裂片段；m/z561.115 5 [C29H25N2(SO3)2]-，是在磺酸根離子外側苯環相連的C—N鍵斷裂形成m/z577.146 2[C30H29N2(SO3)2]-的基礎上，相鄰支鏈末端—CH3同步斷裂后形成的單電荷碎裂片段；m/z481.158 4 [C29H25N2(SO3)]-是在m/z561.115 5基礎上，進一步丟失磺酸根離子后形成的單電荷狀態。

3 結 論