基于三乙胺體系的電致化學發光生物傳感器檢測葡萄糖

李 芹，李 婷，賀 瑩，陳時洪*

(1.重慶市沙坪壩區人民醫院 消化內科，重慶 400030；2.西南大學 化學化工學院，重慶 400715)

近年來，越來越多的人患有糖尿病，糖尿病已成為一個世界性的公共問題，是影響人類生活的重要疾病之一。糖尿病還能引起很多并發癥，如骨質疏松、心血管疾病等[1-2]。測定血清中葡萄糖含量是診斷糖尿病的重要指標之一。因此，簡單、快速和靈敏地測定葡萄糖在醫學檢驗中具有重要價值，對食品工業中質量監控和糖尿病病情監控均有著重要意義[3-4]。目前檢測葡萄糖的方法很多，如化學發光法[5]、比色法[6]、熒光法[7]以及色譜法[8]等。化學發光法對一系列化合物均有響應，選擇性較差；比色法對被測物質的純度要求較高，需要繁瑣的樣品預處理過程；熒光法局限于分析過程中需外加光源，因此不可避免地存在光散射的影響，從而影響檢測靈敏度；色譜法雖檢測的準確性和靈敏度高，但需要專門的儀器以及繁瑣的樣品前處理過程，成本高且費時。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI-A型電致化學發光分析儀(西瑞邁分析儀器有限公司)用于ECL檢測，高壓倍增管設置為600 V，低電位設置0 V，高電位為1.25 V；CHI760E電化學工作站(上海辰華儀器公司)用于循環伏安(CV)和電化學阻抗(EIS)掃描；JEM 1200EX透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)和Thermo escalab 250Xi X射線光電子能譜儀(美國熱電公司)用于材料的XPS表征；實驗使用三電極體系：修飾的玻碳電極為工作電極，鉑電極為對電極，Ag/AgCl或甘汞電極為參比電極。

葡萄糖氧化酶(GOx)、葡萄糖購自Sigma(St.Louis,Mo,USA),Ru(bpy)3Cl2購自蘇州鈉凱科技有限公司,三乙胺(Et3N)購于阿拉丁上海有限公司,三噻吩丙二酸(TA)、氯鉑酸(H2PtCl6)購于北京百靈威科技有限公司,以上試劑均為分析純；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)做測試底液；實驗用水均為超純水。

1.2 Pt NPs和 Pt NPs-Ru復合物的制備

Pt納米粒子(Pt NPs)的制備[10]:Pt NPs通過加熱H2PtCl6和TA的水溶液得到。首先將1.9 mL 0.02 mol/L H2PtCl6稀釋至50 mL，加入0.5 mL 0.3 mol/L TA后，所得溶液于100 ℃下攪拌20 min，即得到深棕色Pt NPs分散液。

Pt NPs-Ru復合物的合成[10]：在上述已制備好的Pt NPs分散液(5.0 mL)中，于劇烈攪拌下緩慢加入0.1 mL 0.04 mol/L Ru(bpy)3Cl2溶液。3 min后，出現大量黑色顆粒，在12 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀并用水洗滌，得到黑色的Pt NPs-Ru復合物，將其分散在2.0 mL水中備用。

圖1 Pt NPs-Ru復合物和傳感器的制備過程Fig.1 Preparation process of Pt NPs-Ru complex and sensor

1.3 傳感器的制備

玻碳電極(GCE，直徑4 mm)經Al2O3粉末拋光后，用水和乙醇超聲清洗干凈。將處理好的電極置于室溫下晾干。移取10 μL Pt NPs-Ru復合物分散液滴涂于電極表面，室溫下靜置使其晾干。將15 μL 20 mg/L GOx 溶液滴涂至Pt NPs-Ru復合物修飾電極，4 ℃下孵育過夜，在水中浸洗，洗掉未被結合的酶，得到所需的ECL傳感器，制備過程如圖1所示。

1.4 檢測方法

使用三電極體系進行檢測。光電倍增管電壓設為600 V，掃描電壓為0～1.25 V。檢測底液為含有10.0 mmol/L Et3N 的3.0 mL PBS溶液(pH 7.4，0.1 mol/L)。測定修飾電極對不同濃度葡萄糖的ECL響應信號。

2 結果與討論

2.1 納米材料的表征

利用透射電子顯微鏡(TEM)表征了Pt NPs-Ru復合物的微觀形貌(圖2A),可清晰觀察到復合物的顆粒結構，由粒徑分布圖可知，其粒徑約1.1 nm(圖2A插圖)。進一步采用X射線光電子能譜(XPS)對Pt NPs-Ru進行表征，其元素組成情況示于圖2B。由圖可清楚地觀察到C1s峰、O1s峰、Pt4f峰以及Ru3p峰。圖2C、D分別顯示了Pt4f區在75.10 eV和71.85 eV處的2個結合能峰以及Ru3p區在464.70 eV處的特征峰。以上結果表明復合物同時存在Ru(Ⅱ)和Pt NPs，證明該復合物已制備成功。

2.2 電極修飾過程的CV、EIS與ECL表征

采用循環伏安法(CV)、電化學阻抗法(EIS)及電致化學發光法(ECL)分別對傳感器的構建過程進行表征。其中CV和EIS測試均在含有鐵氰化鉀(5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6])的PBS溶液中進行。如圖3A所示，裸電極呈現出明顯的氧化還原峰(曲線a)。當電極修飾上Pt NPs-Ru復合物時(曲線b)，由于Pt NPs上所帶的負電荷與[Fe(CN)6]3-/4-發生排斥而阻礙電子傳遞，導致峰電流明顯降低。當電極進一步修飾GOx后(曲線c)，峰電流進一步降低，這是因為GOx同樣對電子傳遞具有阻礙作用。修飾電極過程的EIS表征圖則顯示，隨著Pt NPs-Ru復合物和GOx的修飾，其阻抗圖譜中的半圓直徑逐漸增大(圖3B)，表明阻抗值逐漸增大，表現出與CV相同的變化趨勢，進一步表明傳感器已構建成功。

為了進一步證明傳感器的構建過程，進一步使用ECL進行表征。ECL檢測在3.0 mL含有10.0 mmol/L Et3N的PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)中進行。如圖3C所示，裸電極幾乎不能產生ECL信號(曲線a)，這是因為此時電極不存在任何發光物質。修飾Pt NPs-Ru納米復合物后的電極能產生很強的ECL信號(曲線b)。進一步將GOx修飾至電極表面后，ECL強度有所減弱(曲線c)，這是因為蛋白質大分子阻礙了電子傳遞，從而導致發光強度降低。

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2.3 實驗條件的優化

2.3.1 pH值的影響研究了磷酸鹽緩沖溶液的pH值對體系ECL信號強度的影響。在含有10.0 mmol/L Et3N和1.0 μmol/L葡萄糖的PBS緩沖溶液(3.0 mL)中測試了傳感器的ECL信號隨不同pH值(5.0、6.0、7.4、8.0、9.0)的變化情況，結果如圖4A所示。由圖可知，pH值從5.0增至8.0時，ECL信號隨著pH值的增加而顯著增加。當pH值由8.0變化至9.0時，ECL信號基本穩定。這是由于共反應試劑Et3N為堿性，在pH值5.0和6.0的酸性條件下Et3N被中和，故此時的ECL信號低。考慮到酶催化效果，實驗選用pH 7.4的PBS緩沖溶液作為檢測底液。

2.3.2 Pt NPs-Ru修飾量的影響進一步探究了Pt NPs-Ru在電極上的修飾量對體系ECL信號的影響。在含有10.0 mmol/L Et3N的3.0 mL 0.10 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中測試了傳感器ECL信號隨Pt NPs-Ru在電極上修飾量(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 μL)的變化情況，結果示于圖4B。當修飾量從5.0 μL增至10.0 μL時，ECL信號在不斷增加。當修飾量為11.0 μL和12.0 μL時，ECL信號已超過檢測量程。為了確保檢測的準確度，本實驗選擇Pt NPs-Ru在電極上的修飾量為10 μL。

圖5 傳感器對不同濃度葡萄糖的響應Fig.5 ECL responses of the biosensor for different concentration of glucose glucose concentration(a-g):0.01,0.05,0.1,1.0,5.0,10, 50(×10-6 mol/L);pH 7.4 PBS,Et3N concentration： 10.0 mmol/L;insert：the calibration curve for glucose

2.4 傳感器的性能

2.4.1 標準曲線圖5顯示了傳感器對葡萄糖的響應情況。當葡萄糖濃度由1.0×10-8mol/L增至5.0×10-5mol/L時，傳感器的ECL信號不斷減小,線性曲線示于插圖B。由圖可知，在此范圍內，ECL信號(I)與葡萄糖濃度的對數(lgc)之間有良好的線性關系，其線性方程為I=-1 575.51+(-1 285.98)lgc。相關系數(r2)為0.995 7,檢出限(S/N=3)為5.2×10-9mol/L。將該傳感器的性能與其它方法進行比較，結果見表1。相比于其他ECL方法，本實驗所構建的生物傳感器用于檢測葡萄糖具有更低的檢出限。

表1 不同生物傳感器檢測葡萄糖的比較Table 1 Comparison of different biosensors for the determination of glucose

2.4.2 穩定性與選擇性穩定性和選擇性是傳感器的重要性能。圖6A顯示了在含有10.0 mmol/L Et3N和5.0 μmol/L葡萄糖的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)底液中，目標傳感器連續掃描10圈的ECL響應情況。測得連續掃描10圈所得的ECL信號的相對標準偏差(RSD)為0.88%，說明該生物傳感器具有良好的穩定性。選擇乳糖、蔗糖、麥芽糖和色氨酸作為潛在的干擾物質，測試了傳感器在含有10.0 mmol/L Et3N的0.1 mol/L PBS(pH 7.4)底液中,對0.05 μmol/L葡萄糖以及50.0 μmol/L上述干擾物質的ECL響應情況。如圖6B所示，與空白溶液相比，上述干擾物質對所制備傳感器的ECL響應無明顯影響，而在目標物葡萄糖存在下，ECL響應信號顯著減小，表明所構建的生物傳感器擁有較好的選擇性。

3 結 論