超聲提取蜂膠黃酮的研究

盧燕珊，彭文君，賁永光,

超聲提取蜂膠黃酮的研究

盧燕珊1，彭文君2，賁永光1,2

(1. 廣東藥科大學藥學院，廣東廣州 510006；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部授粉昆蟲生物學重點實驗室，北京 100093)

蜂膠黃酮是蜂膠的主要活性成分，具有抗氧化、抗菌等多種功效。優(yōu)化蜂膠黃酮的超聲提取工藝，為蜂膠產(chǎn)品的開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。首先進行了單因素試驗，研究超聲功率、超聲時間和乙醇濃度這三個因素分別對蜂膠黃酮提取得率的影響。在此基礎(chǔ)上，再采用響應(yīng)面法優(yōu)化蜂膠黃酮的超聲提取條件。研究結(jié)果表明，影響蜂膠黃酮提取得率的主次因素依次是超聲時間、乙醇濃度和超聲功率。當超聲功率為150 W、超聲時間為16 min、乙醇濃度為86%時，蜂膠黃酮提取得率實際最大可達到21.10%±0.075% (=3)。經(jīng)本實驗分析可知，湖北孝感蜂膠屬于蜂膠中的優(yōu)等品。相比于其他超聲提取蜂膠黃酮的方法，該實驗的超聲提取方法具有提取溫度低、提取時間短的優(yōu)勢。

蜂膠黃酮；超聲；提取得率；響應(yīng)面法

0 引言

蜂膠是由蜜蜂采集的樹脂和其腺體分泌物等形成的一種黏性膠狀固體物質(zhì)。蜜蜂用它來修補蜂巢，一方面可以抵御外敵入侵，另一方面可以抑制蜂巢內(nèi)微生物的生長。蜂膠的成分極其復(fù)雜，現(xiàn)已被鑒定其含有20大類共300多種成分，主要含有黃酮類、酚酸類、萜烯類、酯類、甾體類、氨基酸和維生素等[1]。蜂膠的成分并非是一成不變的，它的成分是由地理區(qū)域、采集季節(jié)、植物種類和蜜蜂種群等因素所決定的。蜂膠具有廣泛的藥理活性，如抗細菌、抗真菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)作用[2]。近年來，蜂膠已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、化妝品工業(yè)和藥品工業(yè)等方面。黃酮類化合物是蜂膠的重要活性物質(zhì)，它具有抗氧化、抗微生物、抗癌和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。因此，優(yōu)化蜂膠黃酮的提取工藝，提取蜂膠黃酮的產(chǎn)率，對蜂膠的開發(fā)和研究有重要的參考價值，對工業(yè)和社會的發(fā)展有重要意義。

目前，提取蜂膠黃酮的方法有很多種，主要有浸漬法、加熱回流法、微波提取法、超聲提取法、超高壓提取法和超臨界CO2萃取法。浸漬法操作簡便，但耗時長并且需要大量的溶劑；加熱回流法溶劑用量較小，但操作麻煩，提取時間長，提取溫度較高，活性成分易被破壞；微波提取法工藝簡便，提取時間短，但是較高的提取溫度容易破壞活性成分；超高壓提取法和超臨界CO2萃取法耗時短，耗能低，無污染，但是設(shè)備成本較高[3]。相比于上述的提取方法，超聲提取法設(shè)備簡單，操作簡便，耗時短，效率高，耗能低，溶劑用量較小。超聲波通過機械作用和空化效應(yīng)降低原材料的粒徑大小，有效地破壞細胞結(jié)構(gòu)，加強溶出物的傳質(zhì)速率，從而提高產(chǎn)率[4]。

本實驗以湖北蜂膠為原料，超聲提取蜂膠黃酮，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取工藝，以期獲得最佳提取工藝條件，為蜂膠黃酮資源的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用材料有：蜂膠(湖北孝感蜜蜂養(yǎng)殖場)，蘆丁標準品(上海源葉生物科技有限公司)，DFY-600型萬能粉碎機，F(xiàn)A2004電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)，KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，UV-5500PC紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)，其余化學試劑均為分析純級別。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的制備

采用三氯化鋁比色法測定蘆丁的標準曲線[5]。分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的蘆丁儲備液(質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1)到25 mL容量瓶中，加入5.0 mL三氯化鋁溶液(濃度為0.1 mol·L-1)，然后用95%乙醇定容。搖勻，靜置15 min后，用紫外可見分光光度計測定其在400 nm波長處的吸光度。以蘆丁的質(zhì)量濃度(單位mg·mL-1)作為橫坐標，吸光度作為縱坐標，繪制標準曲線，得到的回歸方程為

式(1)中：為蘆丁的質(zhì)量濃度，mg·mL-1；為吸光度；為相關(guān)系數(shù)。

1.2.2 超聲提取蜂膠黃酮

將粗蜂膠放置在-5℃的冰箱中冰凍24 h后，用萬能粉碎機快速粉碎已變得硬脆的粗蜂膠并通過20目篩，然后將已過篩的蜂膠粉末置于冰箱中保存。實驗流程圖如圖1所示。稱取1 g蜂膠粉末到試管中，加入一定濃度的乙醇溶液20 mL，再將試管固定在超聲清洗槽內(nèi)左上角，槽內(nèi)水的高度為10 cm，試管插入水面以下6 cm。在40℃水溫條件下，用設(shè)定功率的超聲進行處理。結(jié)果顯示，槽內(nèi)水溫在試驗過程中變化較小，基本在40～43℃范圍，試驗可忽略溫度的變化。

1.2.3 蜂膠黃酮提取得率的測定

超聲提取后，將提取液在4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上清液。然后采用三氯化鋁比色的方法測定蜂膠黃酮的含量。蜂膠黃酮提取得率的計算公式如下：

式中：為蜂膠黃酮提取得率，%；為蜂膠黃酮的質(zhì)量濃度，mg·mL-1；為提取體積，mL；為蜂膠的質(zhì)量，g。

1.2.4 實驗設(shè)計

1.2.4.1 單因素試驗

探究超聲功率(120、150、180、210、240 W)，超聲時間(1、6、11、16、21 min)，乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)分別對蜂膠黃酮提取得率的影響。

1.2.4.2 響應(yīng)面試驗

基于單因素試驗的結(jié)果，采用三因素三水平的Box-Behnken試驗設(shè)計(Box-Behnken Design, BBD)進一步優(yōu)化蜂膠黃酮提取的自變量(超聲功率，超聲時間，乙醇濃度)[6]。自變量的水平范圍如表1所示，Box-Behnken實驗設(shè)計如表2所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲功率對蜂膠黃酮提取得率的影響

實驗結(jié)果如圖2a所示。隨著超聲功率的增加，提取得率先增加并在180 W時達到最大值，隨后降低。增加超聲功率會加強空化效應(yīng)，產(chǎn)生更多的空化氣泡，加快傳質(zhì)速率，從而提高提取得率。但是超聲功率太高會破壞蜂膠黃酮的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取得率降低[6]，因此180 W是較佳的提取功率。

表1 Box-Behnken設(shè)計的因素與水平

表2 Box-Behnken設(shè)計的實驗結(jié)果

2.1.2 超聲提取時間對蜂膠黃酮提取得率的影響

實驗結(jié)果如圖2(b)所示。逐漸增加超聲提取時間，提取得率先快速地增加并在11 min時達到最大值，然后緩慢地降低。由超聲波產(chǎn)生的空化氣泡在急劇崩潰破滅時會釋放出很大的能量，這些能量不僅使細胞破裂，而且在固液界面上產(chǎn)生湍流振動，從而加快傳質(zhì)速率，提高提取得率。超聲時間過長可能會導(dǎo)致蜂膠黃酮的分解，造成提取得率降低[7]。因此11 min是較合適的提取時間。

2.1.3 乙醇濃度對蜂膠黃酮提取得率的影響

實驗結(jié)果如圖2(c)所示。當乙醇濃度由50%增加到70%時，提取得率迅速地增加，然而繼續(xù)增加乙醇濃度，提取得率幾乎保持不變。增加乙醇濃度使更多的蜂膠黃酮分子溶解到乙醇溶劑中，從而提高了提取得率。繼續(xù)增加乙醇濃度，提取得率基本不變，可能是因為蜂膠黃酮分子在乙醇溶劑中的溶解接近于飽和狀態(tài)。所以70%是較合適的乙醇濃度。

圖2 超聲功率、超聲時間和乙醇濃度對蜂膠黃酮提取得率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化蜂膠黃酮的提取因素

2.2.1 回歸方程的構(gòu)建與分析

由表2可知，Box-Behnken設(shè)計方案有17個試驗點。通過對試驗點的實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，得到以下的二次多項式回歸方程：

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果

二維的等高線圖跟三維的響應(yīng)面圖用來判斷自變量之間的相關(guān)性。由圖的形狀可看出自變量之間的交互作用是否顯著。橢圓形的等高線圖和彎曲的響應(yīng)面圖表明自變量之間的交互作用顯著。二維的等高線圖跟三維的響應(yīng)面圖如圖3所示。研究其中兩個變量的相關(guān)性時，第三個變量應(yīng)保持不變。圖3(c)的響應(yīng)面圖比圖3(a)和3(b)的響應(yīng)面圖更陡峭，這表明乙醇濃度和超聲提取時間之間的交互作用更顯著，與圖3中的等高線圖和表3中的結(jié)果一致。

2.2.2 最佳超聲提取條件的確定與驗證

通過Design Expert 8.0.6軟件的分析，得到了最佳的提取條件：超聲功率為163.38 W，超聲提取時間為15.89 min，乙醇濃度為85.67%。在此條件下，預(yù)測提取得率為21.11%。為了進一步驗證回歸模型的可靠性和準確性，采用上述的最佳條件進行驗證實驗。考慮到實際情況的可操作性，將最佳條件修正為：超聲功率為150 W，超聲提取時間為16 min，乙醇濃度為86%。在此條件下，蜂膠黃酮的提取得率為21.10%±0.075% (試驗次數(shù)=3)，接近于模型的預(yù)測值，因此證實了該模型準確可靠。

圖3 3種自變量之間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.3 超聲提取方法的比較分析

一般來說，根據(jù)蜂膠黃酮的含量來判斷蜂膠的品質(zhì)，含量在5%以上為合格品，含量大于15%為優(yōu)等品。本實驗的蜂膠黃酮提取得率在最佳超聲提取條件下實際可達到21.10%，所以該實驗所用的湖北孝感地區(qū)的蜂膠屬于優(yōu)等品。

蜂膠黃酮的含量與蜂膠的地域性有直接的關(guān)系，不同地區(qū)蜂膠黃酮的含量差異較大。本次實驗所用的蜂膠尚未有相關(guān)文獻報道，與現(xiàn)有文獻的蜂膠來源不同，所以根據(jù)蜂膠黃酮的得率來判斷超聲工藝的優(yōu)劣是不恰當?shù)模虼酥槐容^提取條件的優(yōu)劣。曹小燕等[7]用超聲提取陜西蜂膠黃酮，得到最佳提取工藝為：超聲時間為20 min，提取溫度為50 ℃，料液比為1:30，乙醇濃度為80%，黃酮的得率為9.60%；李帥[6]通過響應(yīng)面法優(yōu)化吉林蜂膠黃酮的超聲提取工藝，得到最佳提取條件為：超聲時間為27 min，提取溫度為66℃，超聲功率為220 W，乙醇濃度為73%，黃酮得率為23.38%；安硯波等[8]通過實驗得到山東蜂膠黃酮的最佳超聲提取工藝參數(shù)為：超聲時間為25 min，乙醇濃度為72%，超聲功率為82%，實際的黃酮得率為13.07%。與現(xiàn)有報道的蜂膠黃酮的超聲提取工藝相比，本實驗的超聲提取方法具有提取溫度低、提取時間短的優(yōu)點。

3 結(jié)論

本文通過響應(yīng)面法優(yōu)化蜂膠黃酮的超聲提取工藝，得到結(jié)論如下：

(1) 蜂膠黃酮的提取得率隨著超聲功率和超聲提取時間的增加先升高后降低，隨著乙醇濃度的增加先升高后保持不變。

(2) 通過對回歸方程進行方差分析，可得到影響蜂膠黃酮提取得率的主次因素依次是超聲提取時間、乙醇濃度和超聲功率。

(3) 通過響應(yīng)面軟件的分析以及考慮實際操作的可行性，可得到最佳提取條件為：超聲功率為150 W，超聲提取時間為16 min，乙醇濃度為86%。在此條件下，蜂膠黃酮提取得率的預(yù)測值為21.11%。對上述提取條件進行驗證實驗，可得到蜂膠黃酮提取得率為21.10%±0.075% (=3)，接近于模型的預(yù)測值，因此證實了該模型準確可靠。

(4) 目前湖北孝感蜂膠尚未有任何相關(guān)文獻報道，經(jīng)過本實驗的提取工藝優(yōu)化與分析，可知湖北孝感蜂膠黃酮的含量約為21%，大于15%，這說明湖北孝感蜂膠是優(yōu)等品。通過與其他超聲提取蜂膠黃酮的方法進行對比，可知本實驗的超聲提取方法具有提取溫度低、提取時間短的優(yōu)勢。

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Ultrasonic extraction of flavonoids from propolis

LU Yanshan1, PENG Wenjun2, BI Yongguang1,2

(1. College of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong, China; 2. Key Laboratory of Pollinating Insect Biology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100093, China)

Flavonoids are the main bioactive components in propolis, which exhibit a variety of physiological activities such as anti-oxidative and antibacterial effects. Optimization of ultrasonic extraction of propolis flavonoids will provide a theoretical basis for exploitation and utilization of propolis products. Firstly, single-factor experiments are carried out. The effects of three extraction parameters (ultrasonic power, extractiontime and alcohol concentration) on extraction yield of propolis flavonoids are investigated. Secondly, based on the single-factor tests, the ultrasonic extraction conditions of flavonoids from propolis are optimized by usingresponse surface methodology. The experimental results show that the order of factors affecting the extraction yield is extraction time, alcohol concentration and ultrasonic power. The maximum extraction yield of propolis is 21.10%±0.075% (=3) while ultrasonic power is 150 W, extractiontimeis 16 min and alcohol concentration is 86%. According to the analysis of this experiment, it is found that the propolis from Xiaogan, Hubei is identified as premium grade product in propolis. Compared with other ultrasonic extraction methods of propolis flavonoids, the ultrasonic extraction method used in this study has the advantages of lower extraction temperature and shorter extraction time.

propolis flavonoids; ultrasound; extractionyield; response surface methodology

O426

A

1000-3630(2020)-02-0190-05

10.16300/j.cnki.1000-3630.2020.02.011

2019-10-01;

2019-12-27

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部授粉昆蟲生物學重點實驗室開放基金(2017MFNZS06)、廣東省自然資源廳項目(GDOE2019A27)、廣東省科技計劃項目(2016A020210133)

盧燕珊(1993－), 女, 廣東東莞人, 碩士研究生, 研究方向為天然產(chǎn)物超聲技術(shù)。

彭文君,E-mail: pengwenjun@caas.cn

賁永光, E-mail: biyongguang2002@163.com