磷酸化肽段分離富集方法研究進(jìn)展

李 莎，王 露，王 迎，陳 平

(湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410081)

可逆蛋白質(zhì)磷酸化是由特定蛋白激酶和磷酸酶調(diào)控[1-2]的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Post translational modification，PTM)方式之一，參與調(diào)節(jié)機(jī)體生命活動(dòng)的全過(guò)程，如生長(zhǎng)發(fā)育、增殖、凋亡及分化等[3-5]。在真核生物中有1/3的蛋白質(zhì)與磷酸化修飾相關(guān)[6]，主要發(fā)生在絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)殘基側(cè)鏈的羥基上，且磷酸化絲氨酸(pSer)、磷酸化蘇氨酸(pThr)、磷酸化酪氨酸(pTyr)的比例為1 800∶200∶1[7]。鑒于蛋白質(zhì)磷酸化修飾的重要性，基于質(zhì)譜的多種方法被用于蛋白質(zhì)磷酸化修飾鑒定[8]。然而，磷酸化修飾豐度低、高動(dòng)態(tài)性以及非磷酸化肽段的信號(hào)抑制等因素極大地限制了其質(zhì)譜鑒定[9]。因此，針對(duì)質(zhì)譜分析前磷酸化肽的分離純化，是深入研究磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的必要條件。

本文綜述了多種磷酸化肽段富集方法，包括固相金屬離子親和色譜法(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)[10-12]、金屬氧化親和色譜法(Metal oxide affinity chromatography，MOAC)[13-15]、親水相互作用色譜法(Hydrophilic interaction chromatography，HILIC)、靜電排斥親水相互作用色譜法(Ectrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography，ERLIC)、化學(xué)衍生法[16]、強(qiáng)陽(yáng)/陰離子交換色譜法(Strong cation/anion exchange chromatography，SCX/SAX)以及基質(zhì)輔助激光解析電離(Matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI)靶盤富集法等(圖1)。鑒于磷酸化蛋白質(zhì)組的多樣性和復(fù)雜性，以及不同方法對(duì)肽段的偏愛(ài)性差異，目前沒(méi)有一種方法可以富集到所有磷酸化肽。因此多種分離富集方法相結(jié)合被用于磷酸化肽段分析，以提高磷酸化修飾鑒定效率。

圖1 磷酸化肽段富集方法Fig.1 Enrichment method of phosphopeptide

1 色譜分離富集法

1.1 固相金屬離子親和色譜法

固相金屬離子親和色譜法(IMAC)這一概念首次由Porath等[17]提出，主要利用帶正電荷的金屬離子吸附帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)。常用金屬離子包括Fe3+、Ga3+[18]、Al3+、Zr4+[19]以及Ti4+[20]等。傳統(tǒng)的IMAC材料制備條件苛刻，且耗時(shí)耗力。隨著材料相關(guān)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，IMAC材料也不斷創(chuàng)新，制備技術(shù)趨于成熟。如Wang等[21]采用紫外光引發(fā)聚合法制備Zr4+-IMAC單體，該方法制備方便，耗時(shí)短，且Zr4+-IMAC單體易于再生，富集結(jié)果重現(xiàn)性好。基于該方法優(yōu)化的微芯片樣式Zr4+-IMAC單體不僅對(duì)磷酸化肽段具有較高的選擇性，而且與基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)具有很好的兼容性。隨后，Wang等[22]改變傳統(tǒng)的IMAC材料制備方法，制備了一種無(wú)螯和配體的新型共價(jià)有機(jī)骨架-IMAC材料(TpPa-2-Ti4+)，對(duì)磷酸化肽段檢出限可達(dá)4 fmol。隨著科技的發(fā)展，具有超級(jí)特異性的新一代Ti4+-IMAC[23-26]相繼被研發(fā)，與傳統(tǒng)的Fe3+-IMAC相比，這類新型Ti4+-IMAC富集磷酸肽具有高特異性、高富集效率等特點(diǎn)[27]。IMAC的主要缺點(diǎn)是金屬離子與具有酸性氨基酸的非磷酸肽會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合，且富集后含有大量生物試劑，因此質(zhì)譜鑒定前需進(jìn)行脫鹽處理，在一定程度上會(huì)造成樣品量損失，且該法易受pH值、柱基質(zhì)、上樣/洗脫步驟等影響。最近，Zhu等[28]報(bào)道了一種pH/甘草磷控制的Fe3+-IMAC富集法，通過(guò)選擇合適的pH值與甘草磷組合，可有效洗脫單磷酸及多磷酸化肽段，與常用洗脫緩沖液相比，MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)中磷酸化肽段的信噪比可提高3～5倍，且磷酸化多肽的回收率顯著提高。Piovesana等[29]以1 mol/L乙酸和0.4 mol/L檸檬酸鈉為緩沖液，在pH 9.0條件下有效提高了磷酸化肽段的洗脫率。研究表明，50%乙腈、0.1%三氟乙酸可增強(qiáng)β-酪蛋白酶解后磷酸化肽段與Nb5+-IMAC的結(jié)合力[30]。

1.2 金屬氧化親和色譜法

MOAC主要利用樹(shù)脂中金屬原子對(duì)磷酸基氧的高親和力而使磷酸肽得到富集。最常用的材料為TiO2，除此之外，ZrO2[31]、SiO2[32]等也可用于磷酸化肽段富集。Pinkse等[33]首次將TiO2用于蛋白質(zhì)酶解后磷酸化肽段富集，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其適用于從復(fù)雜樣本中富集磷酸化肽[34-35]。Sun等相繼制備了2種用于高效吸附磷酸化肽和糖肽的磁性納米材料，一種是親水三肽包被磁性TiO2的多功能納米復(fù)合材料Mag TiO2-GSH[36]，一種是巰基琥珀酸改性介孔TiO2包被Fe3O4的親水性磁性納米材料Fe3O4@mTiO2-MSA[37]。Zhu等[38]對(duì)傳統(tǒng)TiO2進(jìn)行改性，采用溶膠-凝膠法合成了一種具有更大比表面積的新型TiO2/Bi/Fe/Zr納米材料，對(duì)磷酸化肽段的檢出限可達(dá)4×10-10mol/L。Wang等[39]基于生物材料花粉(Pollen grains，PGs)表面積大、顆粒均勻等特性，合成了一種用于磷酸化肽富集的新型雙金屬氧化物MOAC復(fù)合材料(PGs@(Ti-Zr)O4)，該材料具有選擇性高(β-酪蛋白-BSA=1∶1 500)、檢出限低(0.1 fmol)等特點(diǎn)。隨著材料科學(xué)的進(jìn)步，摻雜磁性納米顆粒的MOAC新型材料也不斷向前發(fā)展，如聚酰亞胺-FexOy-ZrO2[31]、Fe3O4@PDA@MIL-125@Au@L-Cys[40]、Fe3O4@SiO2-磁性納米顆粒[24]、Fe3O4@H-fTiO2[41]等納米復(fù)合材料在磷酸化肽段富集方面表現(xiàn)出較高的富集效率。

MOAC富集效率易受富集體系中不同試劑成分、緩沖液pH值等的影響。因此，復(fù)雜生物樣本中選擇性富集磷酸化肽段成功與否的關(guān)鍵在于能否盡可能降低非磷酸化肽的干擾。對(duì)于富集條件的優(yōu)化，如采用含乳酸[42]、鄰苯二甲酸[43]的洗滌緩沖液，以及含磷酸銨[44]和吡咯烷[45]的洗脫緩沖液，或者是在富集體系中添加2,5-二羥基苯甲酸[46]等，均可改善TiO2的非特異性吸附問(wèn)題。Fukuda等[47]采用甘油添加劑同時(shí)聯(lián)合NH4OH和雙丙烷洗脫緩沖液，提高了TiO2對(duì)單磷酸化肽的選擇性富集效率，在PC3細(xì)胞中鑒定出8 300個(gè)磷酸化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)2 600個(gè)磷酸化蛋白。Klement等[48]發(fā)現(xiàn)離子濃度較低的洗脫緩沖液可有效抑制非磷酸化肽段的吸附，從而洗脫出較多的磷酸化肽段。

比較MOAC和IMAC在內(nèi)的各種磷酸化肽富集方法產(chǎn)生的磷酸化數(shù)據(jù)庫(kù)，可發(fā)現(xiàn)目前還沒(méi)有一種磷酸化肽富集方法能夠完全覆蓋整個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)組。克服這種方法偏差的策略是結(jié)合多種富集技術(shù)來(lái)提高磷酸化蛋白質(zhì)組的覆蓋范圍。

1.3 SCX/SAX富集法

鑒于組織樣本的復(fù)雜性，直接進(jìn)行磷酸化修飾分析充滿挑戰(zhàn)，因此有必要對(duì)磷酸化多肽進(jìn)行分離富集。SCX[49-50]分離富集原理是使帶負(fù)電的磷酸化肽段流過(guò)帶負(fù)電官能團(tuán)的固定相時(shí)，由于靜電排斥作用，較早的被洗脫出來(lái)。而SAX與SCX作用機(jī)制相反，磷酸肽可較強(qiáng)的吸附在陽(yáng)離子固定相中。

SCX是目前常用的高效液相色譜分離方法之一，在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中也有應(yīng)用。在酸性pH值中，胰酶酶解的肽段大多數(shù)帶電荷量為+2，而磷酸化肽段由于含有一個(gè)帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，從而使其帶電荷為+1，尤其是多磷酸位點(diǎn)的肽段會(huì)在SCX的早期分餾物中被洗脫出來(lái)[50]。

帶負(fù)電荷的磷酸化肽比非磷酸化肽具有更強(qiáng)的酸性，更適合用SAX[51]分離富集。研究表明，SCX主要是吸附一些高親水性的以及一些堿性磷酸化肽(pI>8.0)，而SAX吸附的磷酸化肽段pI為2.91～6.45，其中有少部分為強(qiáng)酸性磷酸化肽段(pI<3.0),同時(shí)，一些強(qiáng)酸性的非磷酸化肽會(huì)與磷酸化肽一起被洗脫[49]。若胰酶酶解不充分也會(huì)產(chǎn)生一些內(nèi)源性精氨酸與賴氨酸，從而造成磷酸化肽帶電荷量>1，不與磷酸化肽一起洗脫。基于SCX/SAX分離富集磷酸化肽的特點(diǎn)，Dehghani等[52]將SCX/SAX用于Hela細(xì)胞裂解物磷酸化肽段的富集，其中SCX法鑒定出9 812個(gè)磷酸化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)3 674個(gè)磷酸化蛋白，而SAX鑒定出3 950個(gè)磷酸化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)2 392個(gè)磷酸化蛋白。

1.4 其它色譜富集法

近年來(lái)，HILIC因可以避免質(zhì)譜鑒定前脫鹽等過(guò)程造成的樣品損失，與質(zhì)譜儀具有良好的兼容性[53]，被越來(lái)越多的作為SCX/SAX的替代方法[45,54]。然而，相關(guān)研究表明，HILIC對(duì)多磷酸化肽的分辨率要低于單磷酸化肽[55]。

ERLIC可與其它分離富集技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究[56-57]，其分離富集磷酸化肽基本原理是:在離子交換色譜中，流動(dòng)相為有機(jī)溶劑(如70%乙腈)，帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)會(huì)與色譜填料柱發(fā)生靜電相互作用，而流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑會(huì)增強(qiáng)磷酸化肽段的親水相互作用，從而將磷酸化肽段與非磷酸化肽段分離。ERLIC對(duì)復(fù)雜樣本中磷酸化肽段以及N-糖肽的成功分離富集，引起了學(xué)者們對(duì)于LC-MS鑒定前磷酸化肽段預(yù)分離技術(shù)的關(guān)注[58]。如Loroch等[59]將高靈敏度的ERLIC-SCX/RPLC-MS法用于微克級(jí)的Hela細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定；Hao等[60]將ERLIC與RPLC-MS/MS相結(jié)合，應(yīng)用于大鼠腎臟磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在近3 000個(gè)蛋白質(zhì)中鑒定出583個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

2 化學(xué)衍生法

β-消除反應(yīng)原理是兩個(gè)相鄰碳原子上分別消除一個(gè)原子或原子團(tuán)，生成一個(gè)不飽和鍵的過(guò)程。1986年，Meyer等[61]首次將β-消除/邁克加成反應(yīng)用于cAMP底物Kemptide蛋白磷酸化絲氨酸修飾的鑒定。β-消除/邁克加成反應(yīng)作為一種磷酸化修飾分析新策略，利用親核取代防止磷酸基團(tuán)的中性損失，克服了現(xiàn)存磷酸化富集方法的局限性[62]。Chen等[63]在β-消除/邁克加成反應(yīng)過(guò)程中，引入硫代膽堿，將帶負(fù)電荷的磷酸肽轉(zhuǎn)換為帶正電荷的四元季銨鹽，使電噴霧離子源質(zhì)譜(檢出限低于500 amol/L檢)電離效率增加了100倍。進(jìn)一步研究表明，以胍二硝基乙硫醇[64]和三甲胺半胱胺鹽酸鹽[63]為加成試劑，均可優(yōu)化質(zhì)譜鑒定結(jié)果。當(dāng)磷酸化蘇氨酸位置接近脯氨酸時(shí)，采用2-氨基乙烷硫醇或者其它硫醇邁克加成試劑，可有效轉(zhuǎn)化磷酸化肽段，提高富集效率并減少樣品量損失[65-66]。

然而，β-消除/邁克加成反應(yīng)也存在缺點(diǎn)。首先，該方法涉及多步反應(yīng)，副產(chǎn)物多以及反應(yīng)不完全現(xiàn)象會(huì)增加樣品的復(fù)雜性；其次，親和反應(yīng)添加的Cα不具有立體專一性，會(huì)導(dǎo)致非對(duì)映體混合物的形成[67]，從而會(huì)影響質(zhì)譜對(duì)磷酸化肽的鑒定效率。為解決這些問(wèn)題，研究者通過(guò)引入二硫化基或堿基等不穩(wěn)定基團(tuán)提高磷酸化肽的富集效率[16]。如Nika等[65]通過(guò)在Michael受體反應(yīng)體系中添加EDTA達(dá)到抑制副反應(yīng)產(chǎn)生的目的。

3 MALDI靶盤富集法

常規(guī)磷酸化肽富集方法均是在溶液中完成，富集過(guò)程涉及離心、脫鹽等繁瑣步驟，易導(dǎo)致樣品丟失，限制了其在微量磷酸化肽檢測(cè)中的應(yīng)用。

為了減少樣品損失并對(duì)微量樣品進(jìn)行鑒定，可通過(guò)化學(xué)修飾MALDI靶盤實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽段的原位富集，之后直接進(jìn)行質(zhì)譜分析[68]。這種MALDI靶盤原位富集法所需樣品量少，在減少樣品量損失的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)低豐度磷酸化肽段的鑒定。最近研究表明，盡管TiO2或Ti4+-PDA修飾MALDI靶盤[68-69]富集過(guò)程耗時(shí)短，樣品損失量少，但在溶劑蒸發(fā)期間由于納米顆粒電離與聚集的不穩(wěn)定性，會(huì)造成TiO2形態(tài)以及厚度難以控制，印刷、噴涂、煅燒等過(guò)程也會(huì)導(dǎo)致TiO2損失，此外MALDI靶盤昂貴的價(jià)格也限制了此類方法的應(yīng)用。為了克服這些問(wèn)題，已有報(bào)道采用鋁箔[70]、載玻片[71-72]來(lái)替代商業(yè)化MALDI盤。如Lin等[68]采用原子層沉積(Atomic layer deposition，ALD)法將NH2修飾的TiO2共價(jià)偶聯(lián)到MALDI靶盤，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了TiO2形態(tài)和厚度的有效控制及磷酸化肽的富集；Wang等[73]采用脈沖激光淀積(Pulse layer deposition，PLD)法將多孔TiO2納米顆粒偶聯(lián)到MALDI靶盤上，并在TiO2表面修飾十八烷基三氯硅烷(Octadecyl trichlorosilane，OTS)，極大地提高了磷酸化肽段鑒定的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。Chen等[74]將聚二甲硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)偶聯(lián)到MALDI靶盤，增強(qiáng)了樣本的靈敏度和均一性，使得鑒定到的多肽信號(hào)比未修飾的MALDI靶盤增強(qiáng)了7.1～11倍。隨后，該課題組[75]在此基礎(chǔ)上，將PDMS偶聯(lián)的MALDI靶盤與TiO2結(jié)合，這種二氧化鈦-聚二甲硅氧烷MALDI靶盤(TP)具有樣品重復(fù)性良好、樣品損失率低以及樣本兼容性高等特點(diǎn)，在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中具有很好的應(yīng)用前景。

4 多種方法結(jié)合

4.1 多維色譜技術(shù)

單獨(dú)采用某方法時(shí)，獲得的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)是有限的。研究表明，將SAX、SCX、HILIC、ERLIC與反相液相色譜法(Reversed phase liquid chromatography，RPLC)相結(jié)合，可以顯著降低樣品的復(fù)雜程度，從而增加磷酸化肽段的有效濃度[59]。因此多種技術(shù)串聯(lián)富集磷酸化肽的方法逐漸受到重視。

可根據(jù)磷酸化肽段疏水性、帶電荷狀態(tài)及親水性對(duì)分離富集方法進(jìn)行優(yōu)化，多種色譜方法相結(jié)合可解決不同理化性質(zhì)磷酸化肽段分離富集方面所存在的問(wèn)題，SCX-RPLC-MS/MS是大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的分離富集技術(shù)[76]。

Link等[77]首次采用多維色譜分離技術(shù)SCX-RPLC分析磷酸化蛋白質(zhì)組，此外，SCX/SAX多維反相液相色譜可以有效保留磷酸化肽，增加嗜堿性和嗜酸性激酶底物中陰離子和陽(yáng)離子磷酸化肽的覆蓋范圍[49]。

在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，磷酸化肽段含量低，質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度差等特點(diǎn)，使得實(shí)驗(yàn)所需樣本一般需達(dá)到毫克級(jí)別。為克服這些局限性，Loroch等[59]采用結(jié)合SCX的多維質(zhì)譜鑒定技術(shù)(ERLIC-SCX/RPLC-MS)從100 mg Hela細(xì)胞酶解物中鑒定出7 500多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)3 013個(gè)磷酸化蛋白。與MOAC-Ti4+富集法相比，ERLIC-SCX/RPLC-MS可富集到較長(zhǎng)的酸性磷酸肽，在大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中有良好的應(yīng)用前景。隨后，該課題組[78]又將二維ERLIC-SCX/RPLC-MS磷酸化肽段富集方法細(xì)化為覆蓋全局蛋白質(zhì)組學(xué)的3-D工作流，并成功用于小鼠巨噬細(xì)胞病毒感染小鼠成纖維細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。與2-D富集技術(shù)相比，3-D工作流具有樣品半自動(dòng)化處理潛力，在臨床和生物醫(yī)學(xué)研究中具有良好的應(yīng)用前景。

4.2 多維色譜與MOAC/IMAC法相結(jié)合

目前磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，SCX與IMAC方法相結(jié)合得到了廣泛應(yīng)用[79]。然而SCX-IMAC分離富集磷酸化肽過(guò)程中，酶解、凍干、脫鹽等繁瑣流程易導(dǎo)致樣品損失。Yue等[80]通過(guò)優(yōu)化SCX-IMAC方法，采用multi-IMAC-HLB從3 mg樣本中鑒定出8 969個(gè)磷酸化肽段，而SCX-IMAC從15 mg樣品中僅鑒定出5 519個(gè)磷酸化肽段。Carrera等[50]開(kāi)發(fā)了一種用于生成大規(guī)模磷蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)集(<15 h)的快速分析方法，即HIFU-TiO2-SCX-LC-MS/MS，克服了以往SCX-IMAC分離富集過(guò)程耗時(shí)耗力的缺陷。

在多維色譜分離系統(tǒng)中，HILIC是最理想的一維分離系統(tǒng)。如Zappacosta等[81]根據(jù)磷酸基團(tuán)的親水性以及磷酸化肽段在親水相中的保留度，將HILIC作為IMAC的預(yù)分離技術(shù)從而降低樣品復(fù)雜性，從500 mg大鼠肝臟樣品中富集鑒定出16 000個(gè)磷酸化位點(diǎn)。SIMAC(Sequential elution from IMAC)是一種高通量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，可從多磷酸化肽中分離出單磷酸化肽，提高復(fù)雜樣品中多磷酸化肽的鑒定數(shù)量[82]。此外，SIMAC、HILIC與TiO2多種技術(shù)相結(jié)合可用于微克級(jí)胰島素瘤細(xì)胞裂解物全局磷酸化肽段的鑒定[83]。

酪氨酸由于磷酸化水平較低，常規(guī)富集方法對(duì)磷酸化酪氨酸無(wú)特異性，因此需要基于抗體開(kāi)發(fā)的方法才可達(dá)到對(duì)磷酸化酪氨酸的選擇性富集[84]。如Abe等[85]通過(guò)優(yōu)化常規(guī)磷酸化酪氨酸富集方法，采用磷酸化酪氨酸抗體免疫沉淀法(pY-IP)與Fe3+-IMAC兩步富集磷酸化酪氨酸，從8 mg PC3細(xì)胞裂解物中鑒定出1 000多個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，這種磷酸化酪氨酸蛋白質(zhì)組學(xué)方法具有揭示未知pY信號(hào)模式和識(shí)別新型激酶抗癌靶點(diǎn)的潛力。基于抗體開(kāi)發(fā)的磷酸化酪氨酸富集法不斷創(chuàng)新，Iliuk等[86]開(kāi)發(fā)出的一種高靈敏度的新型蛋白質(zhì)組學(xué)研究工具即基于聚合物的金屬離子親和捕獲(PolyMAC)-抗體組合型方法，在酪氨酸磷酸化所參與的信號(hào)通路研究中具有良好的應(yīng)用前景。

然而，多種方法相結(jié)合富集磷酸肽的過(guò)程不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，也會(huì)造成低豐度磷酸化肽損失。為避免這些方法在磷酸化肽段富集方面存在的偏差，需開(kāi)發(fā)一種不同富集技術(shù)結(jié)合的新型雜合材料，簡(jiǎn)化操作流程。基于MOAC與IMAC對(duì)磷酸化肽段偏愛(ài)性不同的特點(diǎn)，Yang等[87]設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一種多功能納米材料Fe3O4@nSiO2@mSiO2/TiO2-Ti4+，該材料具有較高的比表面積(179.3 m2/g)和吸收性能(133 mg/g)，質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度可達(dá)4 pmol。Wang等[88]制備了一種吡啶醛5′-磷酸鹽介導(dǎo)的固定化金屬親和材料即Fe3O4@SiO2-PLP-Ti4+，減少了非磷酸化肽的非特異性吸附，促進(jìn)了磷酸化肽段的選擇性吸附。

5 展 望

在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中，優(yōu)化磷酸化肽段分離富集方法并不是提高磷酸化蛋白質(zhì)鑒定效率的唯一選擇。有研究報(bào)道質(zhì)譜可提高磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定效率[6,89]，但在質(zhì)譜鑒定前生物樣本的動(dòng)態(tài)變化導(dǎo)致樣品變得復(fù)雜。因此，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究重點(diǎn)之一是開(kāi)發(fā)高選擇性的樣品制備工具，用以富集磷酸化肽和蛋白質(zhì)。

隨著磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)于磷酸化肽段的分離純化技術(shù)要求也不斷增長(zhǎng)。樣品濃縮技術(shù)必須朝著避免目標(biāo)產(chǎn)物損失，減少干擾分子非特異性富集方向發(fā)展。如本文所提到的一些分離富集方法對(duì)于減少非特異性磷酸化肽段的非特異性結(jié)合具有良好的效果。

現(xiàn)如今由于質(zhì)譜儀檢測(cè)范圍有限，在濃度較低的磷酸化肽段檢測(cè)方面經(jīng)常受到阻礙。因此，未來(lái)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究必須致力于提高質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度，以便能追蹤到與疾病相關(guān)的一些含量較低的磷酸化蛋白質(zhì)，這也意味著需研究開(kāi)發(fā)高靈敏度的樣品制備方法，用于富集豐度較低的目標(biāo)分子。